噬菌体聚糖酶的应用

1.噬菌体聚糖酶在细菌胞外多糖结构分析中的应用

国内外有关噬菌体聚糖酶的研究主要集中在利用该酶进行细菌胞外多糖的结构分析方面，细菌胞外多糖经噬菌体聚糖酶降解后，形成特定聚合度的寡糖片段，结合NMR、红外光谱、甲基化等技术分析寡糖片段的结构信息，以最终确定细菌胞外多糖的化学结构，如克雷伯氏菌、醋杆菌、大肠杆菌、弧菌等。图4-15是克雷伯氏菌K13胞外多糖经噬菌体聚糖酶降解后的产物结构。

图4-15　克雷伯氏菌K13胞外多糖经噬菌体聚糖酶降解后的产物结构

2.噬菌体聚糖酶在细菌生物膜研究中的应用

噬菌体聚糖酶还可作为细菌生物膜研究的工具。细菌生物膜是自然界中的一种由多种细菌黏附在一起形成的群体，外面包裹由细菌自身产生的胞外多糖形成的糖被。包被有生物膜的细菌称为“被膜菌”，而那些游离于生物膜之外独立生长的细菌称为“浮游菌”。被膜菌无论其形态结构、生理生化特性、致病性，还是对环境因子的敏感性等都与浮游菌有显著的不同。

生物膜对于保护细菌免受环境因子如干燥或药物的破坏，以及贮存养料和离子极为重要。细菌生物膜对医学的影响则受到了更多的关注，因为细菌生物膜是细菌相互协调构成的具有高度分化结构的复杂群体，这种群体的形成被认为是细菌适应外界环境的重要机制。生物膜赋予细菌对各种因素的抵抗力也是许多持续性和慢性细菌感染的根源，据统计，80%以上的感染性疾病是由被膜菌引发的。生物膜及其糖被的存在，给利用药物杀灭致病性微生物带来更大的难度，生物膜内的细菌几乎对所有的抗菌药物都不敏感，表现出极强的耐药性，重要原因之一就是生物膜阻挡抗生素作用于菌体。因此，利用专一性的噬菌体聚糖酶研究生物膜中糖被的结构，对于明确生物膜细菌的组成及生活习性，并进而研究出破坏生物膜系统结构以及降低病原菌抗药性的方法，具有重要意义（图4-16）。推测认为，将多糖解聚酶与抗生素联合运用，将可能控制由被膜菌引起的感染。

图4-16　细菌生物被膜及其受到噬菌体聚糖酶降解后的扫描电镜照片（引自Wang Shanshan等，2015）

a.细菌生物被膜的整体结构；b.完整细菌生物被膜的胞间介质；c.经噬菌体聚糖酶单独处理6h的细菌生物被膜；d.噬菌体聚糖酶处理4h后，再通过表面消毒剂ClO2处理后的细胞形态。标尺＝
1μm

3.利用噬菌体聚糖酶制备新型寡糖

现有研究表明，糖链作为人体内重要的信息分子，对人类疾病的发生、发展和预测起着重要的作用，参与到多细胞生命的全部空间和时间过程。借助于化学、物理、生物的各种提取、转化、降解、合成以及分子修饰等技术，科研工作者不断开发出多种新型寡糖，并揭示其生物学功能及构效关系。

病原菌侵染宿主组织时，通常对宿主细胞表面的特异性寡糖分子进行识别，将其作为病原菌细胞或其毒素的初级受体部位加以黏附。图4-17为大肠杆菌细胞及其毒素对受体组织的黏附示意图，大肠杆菌的菌毛专一性地识别宿主黏膜细胞表面的甘露寡糖受体位点，而大肠杆菌毒素则会识别宿主黏膜细胞表面的半乳寡糖受体位点。而寡糖可用来制备抑制病原菌或其毒素对宿主组织侵染的受体模拟物— “decoy”寡糖（图4-18）。根据报道，“decoy”寡糖的半数抑制浓度（IC50）可以达到几十毫摩尔每升的水平。

图4-17　大肠杆菌细胞及其毒素对受体组织的黏附示意图

图4-18　“Decoy”寡糖抑制病原菌及其毒素黏附的示意图

虽然寡糖作为生理活性物质和药物先导化合物的开发潜能巨大，但是其重要作用至今还没有得到充分体现，其发展缓慢的原因之一是新型寡糖的批量制备技术相对落后：采用化学手段的降解、合成或转化方法能够提供不同结构的寡糖，但存在特异性差、产物得率低和反应条件难以控制等缺点，而酶学方法又存在新型酶制剂匮乏和活性不高等亟待解决的问题。

借助于噬菌体聚糖酶的酶解技术，为批量制备这些重复寡糖序列提供了可能，从而开发出具有新型生理活性的寡糖因子，为未来研究和批量制备有效药物和食品功能因子提供了丰富的原料。由于细菌胞外多糖组成的均一性，再加上噬菌体聚糖酶作用方式的高度专一性，使得酶解获得的寡糖产物能够保持良好的均一性，保证了寡糖产品的质量和获得率。例如克雷伯氏菌K14的胞外多糖经相应的噬菌体聚糖酶作用后，主要水解产物为有分枝的六糖；克雷伯氏菌K26的噬菌体产生的聚糖酶为β-半乳糖苷酶，水解宿主细胞的胞外多糖后，可以产生出一种新型的七糖。大肠杆菌、霍乱弧菌（V.cholera）等其他多种细菌的荚膜多糖也能够被相应的噬菌体降解，产生特殊结构的寡糖。