石油烃污染土壤中腐植酸对草本植物吸收重金属的影响

石油烃污染土壤中腐植酸对草本植物吸收重金属的影响

Soyoung Park1，Ki Seob Kim2，Daesok Kang2，Hansam Yoon1，Kijune Sung2著陈　昊3　林启美3译

(1　釜庆国立大学海洋产业发展研究中心　釜山　韩国　2　釜庆国立大学生态工程系 釜山 韩国　3　中国农业大学资源与环境学院土壤和水科学系　北京　100093)

摘　要：本文研究了重金属和石油烃复合污染土壤中，腐植酸对草本植物吸收重金属的影响。结果显示：腐植酸大幅度地降低了污染土壤中可溶性和交换态重金属含量，但提高了植物可利用态重金属含量。土壤添加腐植酸后，除Ni外，重金属潜在生物有效性和可淋出性因子大于1，这表明大多数重金属对植物具有潜在的有效性。此外，腐植酸增加了Pb、Cu、Cd和Ni在供试植物幼苗和根部的积累，最高的是高羊茅幼苗，达264.7%，生物富集系数从0.30提高到1.10。芸苔根中Ni和Pb的生物富集系数也有提高。这些研究结果显示，石油烃与重金属同时污染情况下，腐植酸加入可以增强植物吸收重金属，但降低重金属可淋出性，防止地下污染。

关键词：植物萃取　植物有效性　生物富集系数(BCF) 转移系数(TF) 生物有效性和可淋出性因子(BLF)

Effects of Humic Acid on Heavy Metal Uptake by Herbaceous Plants in Soils Simultaneously Contaminated by Petroleum Hydrocarbons

Soyoung Park1,Ki Seob Kim2,Daesok Kang2,Hansam Yoon1,Kijune Sung2 write Chen hao3,Lin Qimei3 translate

(1 Research Center for Ocean Industrial Development,Pukyong National University, Busan, Korea 2 Department of Ecological Engineering,Pukyong National University, Busan, Korea 3 Department of Soil and Water Sciences, College of Resources and Environmental Sciences, China Agricultural University, Beijing, 100093)

Abstract: The effects of humic acid (HA) on heavy metal uptake by herbaceous plants in soil simultaneously contaminated with heavy metals and petroleum hydrocarbons were investigated.The results showed that HA reduced readily soluble and exchangeable forms of heavy metals in the contaminated soil but increased their plant-available forms.Potential bioavailability and leachability factors became larger than 1 after adding HA to the soil, except for those of Ni, suggesting that more heavy metals could be potentially phytoavailable for plant uptake.Furthermore, HA increased the accumulation of Pb, Cu, Cd, and Ni in the shoots and roots of selected plants.The greatest increase in the accumulation of heavy metals was 264.7% in the shoot of Festuca arundinacea, with the bioconcentration factor (BCF) increasing from 0.30 to 1.10.Humic acid also increased the BCFs of the roots of Brassica campestrisfor Ni and Pb.These results suggest that HA amendment could enhance plant uptake of heavy metals, while concurrently reducing heavy metal leachability and preventing subsurface contamination, even in soils simultaneously contaminated with petroleum hydrocarbons.

Key words: phytoextraction; phytoavailability; bioconcentration factor(BCF); translocation factor(TF); bioavailability and leachability factor(BLF)

全球工业化和城市化地区土壤中，重金属浓度均增加。土壤遭受重金属污染，生态和人类健康的风险提高，急需研发多种清洁技术并实施。植物修复重金属污染土壤，被认为是一个成本低且环保的方法。虽然大多数植物都具有吸收重金属的能力，但只有能够在高浓度重金属污染土壤生长的植物，才可以被用于修复重金属土壤。如果这些植物生物量很高，就会吸收比较多的重金属，修复效果会很好。然而，重金属有效性是限制植物吸收的一个重要因素，即使植物可以吸收重金属，但若有效态浓度很低，植物吸收也很少，修复效果很差。因此，污染土壤中的重金属能否被植物成功萃取，取决于重金属生物有效性。

在植物修复中，螯合剂曾被用来提高重金属的生物有效性。然而，类似乙二胺四乙酸(EDTA)与重金属的复合物，对土壤微生物和植物是有毒的，阻碍植物生长。而且这些复合物的生物降解能力低，易残留在土壤中。因此，无毒的且可生物降解的螯合剂，如乙二胺-N、N’-琥珀酸酯和次氮基三乙酸，可代替EDTA。但是，螯合过程中也存在重金属淋出的风险。

腐殖质是天然的螯合剂，是土壤有机质主要组分，是由有机物质再次合成形成的大分子物质组成的混合物。作为腐殖质的组成部分，腐植酸(HA)是一种可通过各类试剂从土壤中提取的暗有机物质，不溶于稀酸。因为腐殖质可以改善土壤物理化学性质，提高土壤肥力，因此，在重金属污染甚至是重金属与石油烃复合污染的土壤中，也能够促进植物生长。腐殖质含有各种活性和相互作用的官能团，如羧基和酚羟基，与重金属络合作用，可以影响重金属在土壤和水中的固持能力和移动性。Halimet al.(2003)认为在富含重金属的土壤中添加腐植酸，降低了可提取态重金属含量，但提高了植物可利用态含量。Evangelouet al.(2004)发现尽管植物可利用态镉的浓度没有显著变化，腐植酸也提高了烟草SR-1对镉的吸收。

土壤如果遭受有机化合物和重金属双重污染，难以利用生物进行修复，因为重金属抑制有机物质降解。但这种污染时有发生，且在土地利用方式改变后，这些污染物通常暴露在外。因此，需要降低污染物浓度至比较低的水平，从而使微生物可以有效地降解有机污染物。由于腐殖质能够促进植物生长，改善矿质营养，因此，也应能促进植物萃取重金属；重金属浓度降低，反过来又会促进微生物降解有机污染物。此外，腐植酸还可以通过为根际微生物提供有利的条件，增强对有机污染物的降解能力。

关于腐植酸对土壤中重金属有效性影响已有一些研究，少数甚至应用到复合污染土壤的重金属植物萃取，但重金属与石油烃双重污染的研究很少。本研究利用石油烃与重金属双重污染土壤，研究腐植酸在提高一系列重金属(如镉、铜、铅和镍等)的植物有效性，以及植物生长方面的作用，同时检测了腐植酸对三种草本植物吸收重金属的影响。

1　材料与方法

1.1　植物的选择及实验设计

污染土壤为人为配制，Pb(400 mg/kg)，Cu(200 mg/kg)，Cd(12 mg/kg)，Ni(160 mg/ kg)，总石油烃(TPHs; 2000 mg/kg)。供试植物为芸苔、高羊茅和向日葵。在人工生长箱中，植物在未污染土壤生长2周，再选四株移植装有污染土壤的不锈钢盆中(高14.5 cm；内径10.5 cm)。温室中生长60 d，白昼14 h，光强 3500±800 lux，湿度45%～50%，温度28±2 ℃，每盆每天浇蒸馏水50 mL，每5 d检测植物茎的长度。

为了评估重金属和石油烃复合污染土壤中，腐植酸对植物吸收重金属的影响，试验设8个处理，随机分组排列，不设重复。试验处理分别为：(1)污染土壤对照(1个盆)；(2)污染土壤+腐植酸(1个盆)；(3)污染土壤分别种植3种不同植物(3个盆)；(4)污染土壤+腐植酸分别种植3种植物(3个盆)，每盆装土1 kg。

1.2　土壤处理

土壤采自韩国釜山釜庆国立大学校园内，自然风干后过2mm筛。加入PbCl2(99%，Kanto，日本)、CuCl2(99%，Acros，比利时)、CdCl2≧2.5H2O(98%，Kanto，日本)和NiSO4≧6H2O(99%，Kanto，日本)，最终含Pb(400 mg/kg)，Cu(200 mg/kg)，Cd(12 mg/ kg)，Ni(160 mg/kg)(韩国环境部，2005)。同时加入市购的柴油(TPH)，76%的直链和支链烷烃以及24%的芳香链烷烃(烷基苯，环烷基苯，烷基萘和多环芳烃)组成(KICT，1998)，TPH浓度为2300 mg/kg。在本研究中，分析正辛烷(C8)到正二十八烷(C28)中的碳氢化合物，来量化柴油中的石油烃浓度。

实验室室温下保持7 d使其稳定后，再按0.1%(w/w)加入市售的腐植酸(Daesin公司，韩国)，腐植酸的元素组成为C(73.1±2.5%)，H(6.2±0.3%)，N(0.7±0.2%)和S(1.2±0.01%)。

土壤理化性质如下：pH值7.71(pH电位计，土水比1:1(w/v)，有机质含量3.82%(直接灼烧法)。阳离子交换量19.14 meq/100 g(1N醋酸置换法，韩国国家农业科学院，1988)，土壤C，N，S含量17.7±1.8%，6.0±0.7%，12.3±1.1%(元素分析仪，Vario macro/micro，德国)。沙粒、粉粒和粘粒用吸管法，分别为77.2%、8.2%和14.6%，根据美国农业部质地分类法为沙壤土。土壤浸出液的Pb、Cu、Cd和Ni采用美国环保局3050B HNO3-H2O2消化法ICP-AES法检测(Perkin Elmer，美国)，分别为33.8 mg/kg、59.6 mg/kg、1.4 mg/kg和14.16 mg/kg。

1.3　土壤分析

分别于试验开始后的第15 d、30 d、60 d，采集根际土壤，测定易溶、可交换态和植物有效态重金属含量。由于土壤中重金属以多种形态存在，因此采用不同的提取剂。易溶和可交换态重金属(RSEM)：取5 g土壤样品于锥形瓶中，加入50 mL 2.5%(v/v)冰醋酸溶液，震荡2 h。植物有效态重金属(PAM)采用二乙烯三胺五乙酸(DPTA)提取法。取5 g土壤于锥形瓶中，加入10 mL含有0.005 M DTPA、0.01 N CaCl2和0.1 M 三乙醇胺的混合溶液，用1 M HCl调节pH值到7.3，震荡2 h。悬浮液在真空条件下用滤纸(Whatman NO.41)过滤，上清液中RSEM和PAM浓度用原子吸收光谱法检测(Perkin Elmer，美国)。

生物有效性和可淋出性因子(Bioavailability and Leachability Factor, BLF)作为一个新的无量纲因子，可简单地表示重金属形态的有效性，以及在土壤中的运移特性。根据下式计算BLF：

公式中，CPAM和CRSEM分别为PAM和RSEM的浓度(mg/kg dw)，当CRSEM比CPAM大时，BLF值小于1，说明更多的重金属可以从系统中淋洗出来。如果BLF大于1，则更多的重金属为植物可利用态，植物可以从土壤中吸收更多的重金属。BLF还可以更清晰地解释，添加腐植酸对重金属形态的改变，以及对植物修复潜力的影响。

1.4　重金属在植物体内的累积

60 d培养结束后，收割植物，小心用去离子水洗除根上的土壤。用HNO3-H2O2消化(US, 1996)，ICP-AES(Perkin Elmer, 美国)测定根和茎的重金属浓度。

生物富集系数(bioconcentration factor, BCF)用以评价重金属在植物中的积累，用下式计算：

公式中，Cplant和Csoil分别为植物和土壤中重金属浓度(mg/kg dw)。

转移系数(translocation factor, TF)用以比较重金属在植物组织内的分布以及从根部向茎的迁移，用下式计算：

公式中，Cshoot和Croot分别表示植物根和茎中重金属的浓度(mg/kg dw)。

1.5　数据分析

对于可影响污染土壤中重金属归宿的3个因素(腐植酸、种植植物、时间)，采用方差分析(ANOVA)和最小显著差法(LSD)(SAS 9.1)进行统计检验，CPAM和CRSEM比较分析采用单因素方差分析和Duncan多重比较法检验差异。

2　结果与讨论

2.1　对植物生长的影响

4种不同条件土壤中芸苔、高羊茅和向日葵茎长度变化如图1所示。除芸苔早期生长迅速，其余植物茎的增长率可以用线性方程表示。所有方程的吻合较好，R2决定系数较高(表1)。当重金属和石油烃的同时污染时，植物生长受到了明显的抑制，其中对高羊茅影响最大，对向日葵的影响最小。所有植物茎增长率：未污染土壤添加腐植酸>未污染土壤>污染土壤添加腐植酸>污染土壤。无论是污染还是未污染土壤，添加腐植酸均起到了积极的作用。添加腐植酸降低了污染物对向日葵生长的抑制作用，说明在重金属和石油烃复合污染的土壤中，腐植酸可以促进植物生长。

图1　4种土壤条件下3种植物60天培养期间茎长的变化

Fig.1 Shoot length over 60 days in four soil conditions

2.2　易溶态和可交换态重金属(RSEM)

不同处理土壤中RSEM的浓度见图2。添加腐植酸降低了RSEM浓度(P﹤0.001，表1)，显然，重金属的溶解度和可淋出性降低，可能是由于腐植酸与重金属形成了稳定的络合物。这与腐殖质含有较多的含氧官能团，如各种类型的羧基、苯酚、羟基和羰基等有关，添加腐植酸显然提高了土壤结合重金属离子的能力。

图2　添加和不添加腐植酸的污染土壤种植不同植物15、30、60天后土壤CRSEM值

Fig.2 Concentrations of readily soluble and exchangeable heavy metals recovered from artificially contaminated soil, depending on humic acid(HA) treatment and plant species, 15, 30, 60 days after the initiation of the experiment

表7　不同处理对土壤水溶性钙含量的影
Tab.7 Effect of different treatments on soil water soluble-Ca content

注：***(P﹤0.001)，**(P﹤0.01)，*(P﹤0.05)，0(P﹤0.1)；上标1表示括号中数值指示与植物种类的比较。

60 d试验结束时，所有处理RSEM量都降低，这可能是由于淋洗及老化有关。如Cu，如果HA对RSEM影响在第15 d比第60 d大很多，说明腐植酸对Cu的影响没有持续很长时间。Halimet等(2003)的研究结果显示，富含有机质的土壤中(2.7%)，Cd、Cu、Ni、Pb和Zn在醋酸中的溶解度随着培养的延长而降低；而在有机质含量较低的土壤中(0.8%)，Cd和Zn在醋酸中的溶解度在30 d和60 d没有发生变化，暗示有机质影响土壤RSEM值的变化，供试土壤有机质含量较高，达到3.82%，显然对RSEM产生影响。

比较添加与未添加腐植酸土壤4种重金属提取量，可以评估腐植酸对CRSEM的影响(图3)。比起不添加HA，添加腐植酸导致Pb、Cu、Cd和Ni的RSEM浓度分别降低了31.2%、8.9%、18.6%和25.3%。种植植物后，Pb、Cu、Cd和Ni的 CRSEM分别减少了高达24.4%～35.2%、10.1%～13.4%、9.5%～25.2%和27.7%～28.9%。显然腐植酸对CRSEM的影响因金属类型而异，Pb和Ni降低的幅度最大，而Cd和Cu则最小(P﹤0.001)，种植植物并不显著地影响HA这种效应。

添加腐植酸后，土壤酸度从pH 7.71升高到pH8.18，但60 d后降低至pH 7.67～7.88。Valliniet al.(1993)报道添加腐植酸后，土壤酸度从pH8.1～8.2升高到pH8.7，继续添加腐植酸，土壤pH还会提高。Hanafi和Salwa(1998)的研究结果显示，当土壤pH高于腐植酸pH时，添加腐植酸会降低土壤pH。重金属溶解度在很大程度上取决于pH，但供试土壤近于中性，因此，pH对重金属溶解度的影响可以忽略。

2.3　植物有效态金属(PAM)

重金属的植物有效性可用PAM表示，结果见图4。与CRSEM相反，添加腐植酸提高所有处理CPAM。无论添加腐植酸与否，所有处理CPAM在60 d培养期间都在变化(P﹤0.01，表1)，但30 d后，种植植物产生明显的差异。对照处理中60 d期间重金属植物有效性稳定下降，但种植植物土壤无论添加腐植酸与否，重金属植物有效性在30 d内上升尔后下降，这可能是因为植物阻碍重金属在土壤中的淋洗，随后被植物吸收所致。

图3　添加腐植酸并种植不同植物60天后土壤四种重金属RSEM和PAM的变化率

Fig.3 Changes in readily soluble and exchangeable metals (RSEM) and plantavailable forms of heavy metals(PAM) in humic acid(HA)-treated pots in comparison with the control pot without both HA amendment and plants at the end of the 60-day experiment

图4　重金属污染土壤各处理培养第15、30、60天土壤重金属植物有效态含量

Fig.4 Concentrations of the phytoavailable forms of heavy metals recovered from the soil contaminated with heavy metals at 15, 30, and 60 days of incubation.a Pb,b Cu,c Cd, and d Ni.HA Humic acid

图5　各处理第60天重金属PAM和RSEM的比值(BLF)　

Fig.5 Ratios of the plant available (PAM) to the readily soluble and exchangeable forms(RSEM) of heavy metals (BLF) at day 60 of the experiment
注：水平线表示BLF为1。

腐植酸对各种重金属的CPAM均有显著的影响(P﹤0.001，表1)，对Cu和Ni的影响最大，其次是Cd和Pb。不种植植物时，添加腐植酸处理Pb、Cu、Cd和Ni的CPAM分别比对照增加了20.9%、148.6%、34.4%和223.7%(图2)，显然，Cu和Ni的增加量大于Cd和Pb(P﹤0.001)。BLFs值为土壤中各种重金属潜在生物有效性与可淋出性的比值，用以评估腐植酸增强植物修复的潜力。图5的结果表明，腐植酸提高了4种重金属的BLFs，分别为：Cu 167.2%～224.7%、Ni 92.7%～107.6%、Cd 65.8%～98.4%、Pb 49.1%～86.9%，显然对Cu和Cd的影响最大，且大于1。比较图3的结果，不难发现Cu的BLF提高是由于CPAM增加所致。但对于Ni，其BLF的增加是由于CRSEM的降低和和CPAM的提高。腐植酸加入到土壤后，4种重金属BLFs顺序为：Pb>Cu>Cd>Ni。BLFs的提高表征重金属植物萃取潜力增强，尽管Ni的BLF小于1，但也不排除被植物吸收，因为植物种类、土壤性质及重金属绝对浓度等均影响重金属的植物萃取。

2.4　腐植酸对植物吸收重金属的影响

图6是不同植物根和茎中的重金属浓度，总体来看，根中的浓度大于茎，添加腐植酸提高了根和茎中的重金属浓度，但幅度存在差异。不同重金属和不同植物种类中，芸苔对Cu的吸收能力最强。BCFs可以指示植物对重金属积累的程度。表2的结果显示，添加腐植酸提高了所有重金属和植物的BCFs，但无论添加HA与否，根部BCFs均高于茎。例外的是，Cu在芸苔中更容易从根部运输到茎。所有植物的根和茎中，Cd的BCFs最高，而Pb则最低。显然，植物对重金属的吸收不仅仅依赖BLFs，不管是否添加腐植酸，芸苔和高羊茅处理的BCFs均高于向日葵。

高羊茅茎Cu的BCF从0.261到0.950，提高了264.7%，幅度最大。添加腐植酸，芸苔根部Ni的BCF从0.781提高到1.797(130.0%)，Pb从0.697提高到1.360(95.1%)，向日葵茎对Cd的吸收增加了0.7%(表2)。但在水体环境，由于水生植物吸收腐植酸，添加腐植酸显著降低了水生植物重金属含量。一些研究人员报道，添加腐植酸降低了苦草Cu和Cd浓度，减少了金鱼藻对Cd和Zn的累积，浮萍对Pb的积累也降低。可见，水生与陆地生态系统，腐植酸对植物吸收重金属的影响机制可能存在差异。

图6　培养60天各类植物根和茎中的重金属浓度

Fig.6 Heavy metal concentrations inashoots and broots of the plant species tested at the end of the 60-day experiment

TF值因植物和重金属种类不同而异，高TF值表示更多的重金属从根部运输到茎，反之则说明植物吸收重金属后，更多地滞留根部。高TF值的重金属，可以通过收获茎，轻易地从污染土壤中去除。添加腐植酸后TF的变化如图7所示。添加腐植酸促进Cd从芸苔根部运输到茎，幅度达51.5%，高羊茅中的Cu也提高了119.6%(图7、表2)。除了芸苔中的Cu，所有植物4种重金属的TFs均小于1。但是，TF值减小并不表示植物吸收重金属量减少，TF仅表征根与茎的重金属浓度比率。如果C茎的增加量小于C根，TF值也可能降低。因此，TF和植物器官中的浓度应同时考虑，从而定量评价重金属在植物体内运输。腐植酸提高茎中TF和BCF的值，说明对重金属污染土壤的植物修复起一定作用。

表2　60天培养结束后4种重金属的生物富集系数(BCF)和转移系数(TF)
Tab.2 Bioconcentration factors (BCF) for the shoots and roots and translocation factors (TF) for four heavy metals at the end of the 60-day experiment

图7　60天培养结束时4种重金属在植物根茎间转移系数(TFs)

Fig.7 Translocation factors (TFs) of the tested plants at the end of the 60-day experiment.HAHumic acid

3　结论

本研究采用人工添加重金属(Cd、Cu、Pb、Ni)的方法模拟重金属污染土壤，研究腐植酸对土壤重金属植物萃取的影响。结果显示，腐植酸降低了RSEM，但提高了PAM，表明通过添加腐植酸可降低土壤中重金属淋淋洗的风险。但是，尽管腐植酸可以降低土壤CRSEM，原位施用腐植酸作为螯合剂，由于重金属的淋出，可能会造成地下水污染。因此，需采用明确的预防措施，如制定严格的检测方案。此外，添加腐植酸可提高重金属的生物有效性，BLFs作为可反应土壤中重金属的生物有效性和可淋出性的指标，添加腐植酸后提高至大于1，而Ni是唯一的例外，这意味着更多的重金属可成为植物可吸收的形态。污染土壤添加腐植酸，所有重金属和植物的BCFs值均高于不添加HA处理，显然，重金属污染土壤添加腐植酸，提高了三种植物吸收累积重金属。本研究结果揭示了在石油烃和重金属复合污染土壤中，可通过施用腐植酸来提高植物萃取一系列重金属(如Cd、Cu、Pb和Ni)。

致谢和参考文献(略)

译自：Environ Earth Sci (2013) 68:2375～2384。