肌糖原的酵解作用

实验二　肌糖原的酵解作用

【实验目的】

1．了解酵解作用在糖代谢过程中的地位及生理意义。

2．学习鉴定糖酵解作用的原理和方法。

【实验原理】

在动物、植物、微生物等许多生物机体内，糖的无氧分解几乎都按完全相同的过程进行。本实验以动物肌肉组织中肌糖原的酵解过程为例。肌糖原的酵解作用，即肌糖原在缺氧的条件下，经过一系列的酶促反应，最后转变成乳酸的过程。肌肉组织中的肌糖原首先磷酸化，经过己糖磷酸酯、丙糖磷酸酯、甘油磷酸酯等一系列中间产物，最后生成乳酸。该过程可综合成下列反应式:

肌糖原的酵解作用是糖类供给组织能量的一种方式。当机体突然需要大量的能量，而又供氧不足(如剧烈运动)时，则糖原的酵解作用可暂时满足能量消耗的需要。在有氧条件下，组织内糖原的酵解作用受到抑制，而有氧氧化则为糖代谢的主要途径。

糖原酵解作用的实验，一般使用肌肉糜或肌肉提取液。使用肌肉糜时，必须在无氧条件下进行;而用肌肉提取液，则可在有氧条件下进行。因为催化酵解作用的酶系统全部存在于肌肉提取液中，而催化呼吸作用(即三羧酸循环和氧化呼吸链)的酶系统，则集中在线粒体中。

糖原或淀粉的酵解作用可由乳酸的生成来观测。在除去蛋白质与糖以后，乳酸可以与硫酸共热变成乙醛，后者再与对羟基联苯反应产生紫红色物质，根据颜色的显现而加以鉴定。

该法比较灵敏，每毫升溶液含1～5μg乳酸即有明显的颜色反应。若有大量糖类和蛋白质等杂质存在，则严重干扰测定，因此实验中应尽量除净这些物质。另外，测定时所用的仪器应严格地洗干净。

【实验材料】

兔肌肉糜。

【实验器材】

试管1．5 cm×15 cm(×8)及试管架、移液管5 ml(×2)、移液管2 ml(×1)、移液管1 ml(×2)、滴管、量筒10 ml(×4)、玻璃棒、恒温水浴锅等。

【药品试剂】

1．对羟基联苯试剂:称取对羟基联苯1．5 g，溶于100 ml 0．5% NaOH溶液，配成1．5%的溶液。若对羟基联苯颜色较深，应用丙酮或无水乙醇重结晶。放置时间较长后，会出现针状结晶，应摇匀后使用。

2．0．5%糖原溶液(或淀粉溶液)。

3．液体石蜡。

4．10%三氯乙酸溶液。

5．氢氧化钙(粉末)。

6．浓硫酸、饱和硫酸铜溶液。

7．0．067 mol/L磷酸缓冲液(pH7．4)。

【实验方法】

1．制备肌肉糜:将兔杀死后，放血，立即割取背部和腿部肌肉，在低温条件下用剪刀尽量把肌肉剪碎成肌肉糜。注意，应在临用前制备。

2．肌肉糜的糖酵解:

(1)取2支试管，编号后各加入新鲜肌肉糜0．5 g。1号管为样品管，2号管为空白管。向2号空白管内加入20%三氯乙酸3 ml，用玻璃棒将肌肉糜充分打散，搅匀，以沉淀蛋白质和终止酶的反应。

(2)分别向2支试管内各加入3 ml磷酸缓冲液和1 ml 0．5%淀粉溶液(或0．5%糖原溶液)。用玻璃棒充分搅匀，加1 ml液体石蜡隔绝空气，并将2支试管同时放入37℃恒温水浴中保温。

(3)1．5小时后，取出试管，立即向1号管内加入20%三氯乙酸3 ml，混匀。将各试管内容物分别过滤，弃去沉淀。

(4)量取每个样品的滤液5 ml，分别加入到已编号的试管中，然后向每管内加入饱和硫酸铜溶液1 ml，混匀，再加入0．5 g氢氧化钙粉末，用玻璃棒充分搅匀后，放置30分钟，并不时搅动内容物，使糖沉淀完全。将每个样品分别过滤，弃去沉淀。其过程可按表5-4程序操作。

表5-4　　　　　　　肌肉糜的糖酵解过程

3．乳酸的测定:取2支洁净、干燥的试管，并编号，每个试管加入浓硫酸1．5 ml，将试管置于冰水浴中，再加入对羟基联苯试剂3滴，勿将对羟基联苯试剂滴到试管壁上，混匀试管内容物。分别取每个样品的滤液0．2 ml，逐滴加入到已冷却的上述浓硫酸溶液中，随加随摇动试管，避免试管内的溶液局部过热。

将试管内容物混合均匀后，放入沸水浴中煮5分钟，待显色后即取出，比较和记录各试管溶液的颜色深浅，并加以解释。具体步骤如表5-5所示。

表5-5乳酸测定

4．结果分析:1号和2号试管液体均可变色，但试管1的颜色较深;试管2显色是由于试验样本肌肉糜中原本含有一定的乳酸，但量较少。

【注意事项】

1．对羟基联苯试剂一定要经过纯化，使其呈白色。

2．在乳酸测定中，试管必须洁净、干燥，防止污染，以免影响结果。

【思考题】

1．人体和动植物体中糖的储存形式是什么?实验时，为什么可以用淀粉代替糖原?

2．本实验关键环节是什么?应采取什么措施?为什么?