蛋白酶溶液配制

实验四　基因组DNA的提取

实验原理

基因组DNA以从白细胞中制备最为方便。分离白细胞的方法有低渗法和右旋糖酐法，一般多采用前者。不论何种细胞中的核DNA，其制备原则都一样，即要将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净，同时要保持DNA的完整性。在提取DNA的反应体系中，SDS（十二烷基硫酸钠）将细胞膜、核膜破坏，并将组蛋白从DNA分子上拉开，使核蛋白与核酸分离。EDTA抑制细胞中DNA酶的活性。蛋白酶K将所有蛋白降解成小肽或氨基酸。标本在上述反应体系中保温一定时间后，用饱和酚、氯仿抽取或用饱和醋酸钠进一步处理使蛋白与核酸分开，再用异丙醇将小分子与大分子分离，经过上述步骤使得DNA分子尽量完整地分离出来。

一、经典法

实验材料

15mL塑料离心管，塑料吸头，毛细吸管，10mL吸管，恒温水浴箱，水平离心机，全血，蛋白酶K，10%SDS，红细胞裂解液（RCLB），白细胞裂解液（WCLB），TE液。

实验方法

（1）5%EDTA－Na₂抗凝全血5mL（抗凝剂的体积∶血的体积＝1∶5），1 500r/min离心5min，吸取粒细胞层，置于另一支15mL塑料离心管中。

（2）加RCLB 10mL，混匀，1 500r/min离心10min。

（3）弃上清液，加RCLB 5mL，混匀，1 500r/min离心5min。

（4）弃上清液，加WCLB 3mL、蛋白酶K（10mg/mL）80μL、10%SDS 50μL，混匀，于56～59℃水浴30min。

（5）加入1/4体积（750μL）的饱和醋酸钠，剧烈震荡15s，离心，1 500r/min离心15 min，将上清液倒至另一支15mL塑料离心管中。

（6）于上清中加入等体积（大约4mL）的异丙醇，轻轻混匀，DNA呈絮状析出。将DNA吸出，放入Eppendorf管内。

（7）用预冷的70%的乙醇洗涤DNA，共3次。弃上清液，于室温中放置3～5min，加TE液溶解DNA（注：DNA不能过分干燥，否则极难溶解）。

二、快速微量法

实验材料

1．5mL的塑料离心管；可调微量加样器；塑料吸头；恒温水浴箱；水平高速离心机；全血；蛋白酶K（10mg/mL）；10%的SDS；灭菌的ddH2O；饱和醋酸钠；TE液；蛋白酶K缓冲液（0．375mol/L NaCl，0．12mol/L EDTA，pH值为8．0）；红细胞裂解液（0．32mol/L蔗糖，1%的Triton－100，5mmol/L MgCl₂，12mmol/L的Tris－HCl，pH值为8．0）。

实验方法

（1）分离白细胞：含5%的EDTA－Na₂的抗凝全血0．5mL（抗凝剂的体积∶血的体积＝1∶5），加入1mL红细胞裂解液，混匀，13000r/min离心1min，弃上清液。沉淀用1 mL ddH2O洗一遍，弃上清液。

（2）蛋白质的消化：加80μL蛋白酶K缓冲液，40μL10%的SDS，30μL蛋白酶K，220μLddH2O混匀，56℃孵育10min。

（3）饱和醋酸钠沉淀蛋白质：加入1/4体积（100μL）的饱和醋酸钠，剧烈震荡15s，13000r/min离心6min，将上清液倒至另1个Eppendorf管内。

（4）异丙醇沉淀DNA：加入与上清液等体积的异丙醇，轻轻混匀，DNA呈絮状析出，13000r/min离心1min，收集DNA。

（5）洗涤：用预冷的70%的乙醇洗涤DNA，共3次。弃上清液，于室温放置3～5 min，加TE液50μL（注：DNA不能过分干燥，否则极难溶解）。