真菌的形态检验技术

一、真菌的形态检验技术

(一)标本的采集

1．皮肤癣菌感染标本采集皮屑、甲屑前先用75%乙醇消毒;取甲屑时用细挫或牙科磨钻取病甲与正常甲交界处并且贴近甲床部的甲屑;病发标本(变色，无光泽，弯曲，脆易折断，松动易拔除)用75%乙醇消毒后拔取置于无菌平皿内送检。

2．血液及体液血液标本应无菌采血3～5 mL于无菌抗凝管中。脑脊液采集3～5 mL，胸腔积液不少于20 mL，离心后以无菌吸管吸取离心沉淀物镜检或培养。

3．其他标本①脓液:脓肿未破损者取无菌注射器抽取，已破损者采集深部脓液。②痰液:晨起漱口后深咳收集痰标本，集于无菌瓶中。③尿液:晨起中段尿或导尿10 mL，离心取沉淀。④粪便:粪便纸盒送检，挑取黏液、脓血、乳酪样部分。⑤阴道及宫颈分泌物:标本置无菌平皿中立即送检，一般取两份标本，一份用于涂片、染色、镜检，一份用于分离培养。

标本采集需严格无菌操作，避免污染杂菌。一般真菌标本需在用药前采集，对已用药者则需停药一段时间后再采集标本。采集的标本量要足，皮屑标本两块，活体组织两份(一份送病理科检查，一份作镜检和培养)。标本采集后立即送检，深部真菌标本最长室内环境下储存不得超过2 h。

(二)直接镜检

直接镜检具有重要诊断意义，如镜检发现真菌菌丝或孢子可初步判定为真菌感染;发现念珠菌的厚膜孢子可初步判断其属。但有时亦有假阳性结果，因此对直接镜检可疑结果应做复查或用其他检验方法　鉴定。镜检阴性结果亦不能排除真菌感染。

1．标本的制备将标本置于载玻片上，加一滴处理液，盖上盖玻片，放置片刻或微加热，但不应使其沸腾，然后轻压盖玻片，驱逐气泡并将标本压薄，用棉拭或吸水纸吸去周围溢液，置于显微镜下检查。制片时，根据不同的标本滴加不同的处理液。

(1)氢氧化钾溶液:本液适于检查致密的难以透明的材料(如毛发、指甲、鳞屑等)。皮屑标本用10% KOH制成湿片，甲屑用25% KOH或加入10%甘油制成湿片，加盖玻片在火焰上微微加热后观察。

(2)生理盐水:为观察真菌的出芽现象，在载玻片上滴1滴生理盐水，将所采集的标本均匀涂在载玻片上，自然干燥后，火焰固定或甲醇固定。脓汁、尿、粪便等标本，可滴加少量生理盐水后直接镜检。

(3)水合氯醛－苯酚－乳酸封固液:此液透明力较强，只限于不透明标本的检查。

2．显微镜检查先用低倍镜观察有无菌丝和孢子，再用高倍镜检查其特征。

(三)染色镜检

1．革兰染色　所有真菌、放线菌均为革兰染色阳性，被染成蓝黑色。该染色法适用于酵母菌、孢子丝菌、组织孢浆菌及诺卡菌、放线菌的感染。

2．乳酸酚棉蓝染色　用于各种真菌培养物的镜检。

3．印度墨汁　用于检测脑脊液(CSF)中的新生隐球菌。

4．糖原染色　又称为过碘酸锡夫染色(PAS)。用过碘酸作氧化剂，使真菌胞壁多糖物质被氧化而释放出醛基，与试剂中的亚硫酸复红及焦亚硫酸钠作用而显示红色。可用于标本直接涂片的染色、组织切片的染色，也可对已进行苏木紫伊红染色的组织切片重染。真菌呈红色，背景淡绿色，细胞核蓝色。糖原、透明质酸、黏蛋白、透明蛋白、血纤维蛋白及胶质颗粒等都呈红色。

5．荧光染色　有直接涂片、培养涂片和组织切片染色三种方法　。用0．1%吖啶橙对标本涂片和组织切片进行染色，在荧光显微镜下观察，白假丝酵母菌、皮炎芽生菌、球孢子菌为黄绿色，新型隐球菌、鼻孢子菌为红色，组织胞浆菌红黄色，曲霉菌为绿色。

6．嗜银染色(GMS)　基本原理　与PAS染色法相同，本法用铬酸代替过碘酸。真菌被染呈黑色或黑褐色，菌丝内部为灰紫色，糖原、黏蛋白为淡红色。主要用于测定组织内真菌。