特殊耐药菌检测

一、特殊耐药菌检测

(一)耐甲氧西林葡萄球菌检测

2005年CLSI推荐使用头孢西丁(30μg/片)代替苯唑西林检测耐甲氧西林的葡萄球菌(Methecillin resistance staphylococcus，MRS)。纸片扩散法抑菌圈直径≤21 mm的金黄色葡萄球菌和路登葡萄球菌以及抑菌圈直径≤24 mm的凝固酶阴性葡萄球菌被称为MRS。肉汤稀释法头孢西丁M IC≥4μg/mL的金黄色葡萄球菌和M IC≥0．5μg/mL的凝固酶阴性葡萄球菌被称为MRS。

MRS不论其体外药敏试验结果如何，提示其对所有青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类以及β－内酰胺类与β－内酰胺酶抑制剂的复方制剂耐药。绝大多数的MRS常提示多重耐药，包括对氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、克林霉素等耐药。

(二)克林霉素诱导耐药的葡萄球菌检测

按纸片扩散法接种受试葡萄球菌，距红霉素纸片(15μg)边缘15～26 mm处放置克林霉素纸片(2μg)，35℃孵育18～24 h。邻近红霉素一边的克林霉素抑菌圈变平或变窄即为克林霉素诱导耐药葡萄球菌。由于抑菌圈直径出现“截平”现象，像字母D，因此，克林霉素诱导耐药试验也称为“D”试验(D－Test)。克林霉素能够被红霉素诱导耐药，临床用克林霉素治疗可能无效。

(三)青霉素耐药肺炎链球菌检测

由于青霉素纸片扩散法不能准确测试肺炎链球菌对青霉素的敏感性，只能用苯唑西林纸片进行筛查。当苯唑西林抑菌圈≥20 mm，说明此株菌对青霉素敏感，也对其它β－内酰胺药物敏感;当抑菌圈直径≤19 mm时，应该检测对青霉素的M IC值以确证是否为青霉素耐药肺炎链球菌(Penicillin resistant streptococcus pneumonia，PRSP)。青霉素的M IC＞0．06μg/mL应视为PRSP。对青霉素敏感的PRSP对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、第二代和第三代头孢菌素、亚胺培南等均敏感。

(四)万古霉素耐药肠球菌检测

将万古霉素(30μg)纸片贴在已接种一定浓度菌液的M－H培养基表面，35℃孵育24 h后观察结果。当万古霉素纸片抑菌圈直径≤14 mm或(和)抑菌圈内发现任何生长，稀释法万古霉素M IC≥32μg/mL均为万古霉素耐药肠球菌(Vancomycin resistant enterococcus，VRE)。VRE的检出提示不能使用万古霉素进行治疗，应选择替考拉宁、利奈唑烷等对肠球菌敏感的药物进行治疗。

(五)氨基糖苷类高水平耐药肠球菌的检测

肠球菌因对低水平的氨基糖苷类天然耐药，但治疗中可选用高水平的氨基糖苷类药物，因此，有必要检测肠球菌对高水平的氨基糖苷类的耐药性。

将庆大霉素(120μg)纸片贴于M－H琼脂表面，35℃孵育16～20 h后观察结果。若抑菌环直径≤6 mm为耐药，表示待测菌为氨基糖苷类高水平耐药的肠球菌(high－level aminoglycoside resistant enterococci，HLARE)。对抑菌环直径为7～9 mm的菌株，应该用稀释法测定其M IC，以确定细菌对药物是敏感还是耐药。

临床对肠球菌引起的全身性感染的治疗常采用青霉素类抗菌剂加氨基糖苷类抗菌素联合用药。肠球菌如对高水平的氨基糖苷类耐药，说明氨基糖苷类药物与作用于细胞壁的抗菌药物如氨苄西林、青霉素或万古霉素没有协同杀菌作用，不能联合应用　;敏感提示氨基糖苷类药物与对该菌敏感的氨苄西林、青霉素或万古霉素有协同杀菌作用，能联合应用　治疗。

(六)超广谱β－内酰胺酶肠杆菌科细菌检测

超广谱β－内酰胺酶(Extended Spectrum Beta－Lactamases，ESBLs)是水解青霉素、头孢菌素及单胺类抗生素的酶，其主要耐药机制是细菌产生一类新的β内酰胺酶，由于这类酶能水解的抗生素比广谱β－内酰胺酶多，故称之为超广谱β内酰胺酶。主要由克雷伯菌和大肠埃希菌产生，此外也在肠杆菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、沙雷菌属等其他肠杆菌科细菌及非肠杆菌科菌，如不动杆菌和铜绿假单胞菌中被检出。ESBLs检测有纸片扩散法和稀释法。现介绍纸片扩散法。

1．初筛试验选用头孢他啶30μg、头孢曲松30μg、头孢噻肟30μg、氨曲南30μg等一种以上药物按常规标准纸片扩散法进行操作。当头孢他啶≤22 mm、头孢曲松≤25 mm、头孢噻肟≤27 mm、氨曲南≤27 mm，符合其中任何一项以上均应高度怀疑为ESBLs菌株，应进一步作确认试验来确诊。

2．确证试验使用每片含30μg头孢他啶、头孢噻肟纸片和头孢他啶/克拉维酸(30μg/10μg)、头孢噻肟/克拉维酸(30μg/10μg)复合物纸片进行试验，分别测量2种不加克拉维酸纸片及加克拉维酸纸片的抑菌环直径。当两个中任何一种药物在加克拉维酸后抑菌环直径大于或等于不加克拉维酸的抑菌环直径5 mm，可确证该菌株产ESBLs。

产ESBL的肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、大肠埃希菌、和奇异变形杆菌，不论其体外药物敏感试验结果如何，对所有青霉素类、头孢菌素类包括第四代头孢菌素头孢吡肟以及氨曲南均应视为耐药。