骨组织工程

因创伤、感染、肿瘤切除和发育不良等所造成的骨缺损，是骨科修复与重建治疗中经常面临的棘手问题。自1993年Vacanti等利用牛成骨细胞与聚羟基乙酸构建组织工程骨以来，骨组织工程便成为组织工程研究领域中活跃的部分。

临床治疗骨缺损的手段包括：自体骨、同种异体骨移植及其他人工材料植入等，这些方法均存在不同程度缺陷，目前尚无理想的具有生物活性、来源广泛、无免疫原性的骨缺损修复材料。近年来，组织工程学的发展为这一医学难题的解决开辟了新途径。目前某些关键技术已经取得阶段性成果，甚至在个别国家或地区已试用于临床治疗。

（一）种子细胞

早期研究的重点是成骨细胞，它可以从骨膜、骨小梁和骨髓中直接分离获得，其主要功能是合成、分泌骨基质并促进基质矿化形成骨组织，最后在骨陷窝内演变为骨细胞。但是获取大量的成骨细胞对机体的创伤比较严重，而且成骨细胞的体外扩增能力有限。后来发现骨髓基质细胞具有一定的诱导成骨作用，在动物实验中表现出促进骨缺损修复。骨髓基质细胞是一组成分不均一的细胞群，该细胞扩增能力也有限，促进骨修复的细胞可能是其中的成骨细胞和可被诱导的干细胞或祖细胞。MSCs是目前认为相对理想的种子细胞，对机体创伤小、安全、可靠，以自体细胞进行组织构建则可将免疫作用降到最低限度。目前对MSCs体外扩增培养条件进行了大量研究，利用该细胞的理化特性建立了体外获得的基本方法，即采用密度1.077的Ficoll液或密度1.073的Percoll液来进行骨髓细胞梯度离心获得单个核细胞，再结合细胞换液进一步除去不贴壁的血细胞。为了增加干细胞纯度，也可以利用细胞表面特异性抗原来分选细胞，如采用CD44＋标记的流式细胞仪或免疫磁珠分选技术。MSCs向成骨细胞表型诱导的体外方法主要有2类：①在培养体系中加入化学药物，如地塞米松、β-甘油磷酸、维生素C或维生素D3等；②利用生长因子促进细胞分化，如BMP2、BMP7等。

（二）支架材料

目前尚无公认的性能最佳的支架材料，对以下几种材料研究得相对深入：①骨组织衍生材料，较好地保留了材料的孔隙结构和机械强度，并降低了抗原性，但同时也降低了材料的骨诱导性；②胶原材料，能够促进细胞黏附增殖，但材料机械强度低，难以单独使用；③羟基磷灰石材料，机械强度高、骨传导性好，但材料降解与骨再生难以同步；④磷酸三钙类陶瓷材料，机械强度高、材料降解与骨再生可以同步，但材料孔隙率偏低、脆性大且难以塑形；⑤聚羟基乙酸和聚乳酸，生物相容性好、高孔隙率及可控的降解率，但材料降解的酸性微环境不利于成骨；⑥藻酸盐聚合物，可通过注射方式填充骨缺损区，但难以单独使用。Kasten等在同一实验条件下比较了骨髓基质细胞分别在脱钙骨基质、羟基磷灰石和磷酸三钙陶瓷内的增殖分化情况，发现3种材料均可以促进种子细胞增殖和成骨分化，但在脱钙骨基质内细胞分布最良好、骨钙素表达最高。在研制新型复合材料方面，磷酸三钙陶瓷与Pluronic水凝胶复合，使得材料不仅具有较高的机械性能，还使种子细胞在材料内分布更均匀。

（三）生长因子

在骨修复过程中，促进骨再生的生长因子包括：BMPs、TGF-β、碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍化生长因子、胰岛素样生长因子等，这些生长因子表现出网络式的有序作用。除了BMPs具有强烈的体内异位诱导成骨外，其他单一生长因子的骨诱导作用有限，但是具有促进骨再生的协同作用，这些生长因子还被广泛应用于种子细胞的体外扩增和表型诱导实验。

（四）三维动态培养

在培养瓶中扩增细胞是二维方式，在倒置显微镜下比较容易观察细胞形态、数量等，但是这与细胞在体内所处的三维环境迥然不同。近年来将种子细胞与支架材料复合后，以三维立体方式进行培养，使细胞更接近体内的功能状态，其较高的细胞密度有利于骨组织形成。Kinoshita等将骨祖细胞接种于三维网状胶原支架内复合培养，12周后检测发现骨祖细胞在该状态下出现良好的增殖分化表现，形成了类似于正常骨组织的结构。研究表明，旋转式细胞培养系统比较适宜培养组织工程骨。复合体在该系统中被浸泡于培养液内，随着水平转轴而移动，由于该系统无明显破坏性应力产生，同时复合体被模拟处与微重力状态，因此细胞在支架材料内分布较均匀、增殖速度较快、分化状态较好、细胞密度较大。Terai等将旋转式细胞培养系统增加气体交换装置后，有效地解决了支架材料中O2渗透和CO2排除的问题，MSCs与PGLA构建的组织工程骨在该反应器中，培养2周时出现钙化情况，培养7周时细胞即被形成的骨样组织包裹。

（五）促进血管化措施

血管化和骨再生是骨愈合过程中的两个最基本环节。体外构建的组织工程骨，植入体内后同样必须迅速建立充分的血供，为种子细胞功能活动提供充足的营养，只有这样才能保证组织工程骨的成活及骨缺损的修复，这在完成较大骨缺损修复时显得尤为重要。目前促进组织工程骨血管化的技术主要有5种。①包裹血管束法；②预构带血管蒂的组织工程骨肌骨瓣；③带血管蒂筋膜包裹法；④应用血管内皮细胞；⑤应用促血管生成的生长因子。当然也有将上述方法联合应用的尝试，以最大限度的提高血管化的速度。

（六）动物实验

应用组织工程学技术修复骨缺损的实验首先在鼠、兔、犬、羊等动物模型中获得成功，由修复颅骨骨缺损、肢体骨腔隙性骨缺损过渡到修复四肢长骨骨缺损，修复的范围逐渐扩大、效率逐步提高。如Kadiyala等将鼠MSCs扩增培养后，以7.5×106个/ml的密度种植到羟基磷灰石/磷酸三钙材料内，植入长约8mm的股骨干骨缺损处，8周后观察到每个植入体均有新骨形成；后来Bruder等将犬MSCs体外扩增后种植到羟基磷灰石/磷酸三钙材料内，植入犬自体股骨干21mm的骨缺损处，16周后观察到大量骨痂生长，骨折愈合；单纯MSCs而无HA/TCP植入组骨痂形成少，骨折仍未愈合，这也说明支架材料是取得良好效果的另一重要条件。

（七）临床初步应用

随着MSCs与成骨性支架材料的深入研究，采用组织工程学技术修复骨缺损的治疗已开始临床Ⅰ期试验，Quarto等将扩增的自体MSCs与HA材料复合后，成功修复3例长骨大节段骨缺损。国内杨志明等将自体MSCs扩增后与生物衍生骨支架复合，成功修复患者的3条肋骨骨缺损；另外杨志明等将异体骨膜源性成骨细胞与人骨衍生材料复合构建出组织工程骨，成功地修复52例骨缺损，经过10～28个月随访而无明显并发症出现；但文中作者也指出异体细胞和该材料存在潜在的免疫反应，目前尚不能作为常规植骨材料广泛应用于临床。曹谊林等自1999到2002年间，选择颅颌面骨缺损病11例进行组织工程骨移植研究，术后1～2.5年的随访表明组织工程骨稳定存在，无明显骨吸收现象，临床治疗效果稳定。