血浆最大聚集率与血小板聚集率

（一）血小板计数

参见《临床检验基础》

（二）血块收缩试验

【原理】血块收缩试验（clot retractiontest，CRT）主要用血浆法。在富含血小板血浆中，加入Ca2+或凝血酶，促进血浆凝固，血小板收缩蛋白使血小板伸出伪足收缩，纤维蛋白网收缩，血清析出。测定析出血清的多少，反映血小板血块收缩的能力。

【器材】离心机、水浴箱、刻度小试管、刻度吸管、无菌注射器等。

【试剂】

1. 0.05mol/L氯化钙溶液或20U/ml凝血酶溶液。

2. 0.109mol/L枸橼酸钠溶液。

【操作】

1.静脉采血，用0.109mol/L枸橼酸钠溶液按血液与抗凝剂9:1抗凝，转速1000r/min，离心10min，分离富含血小板血浆（PRP），剩余血液以转速30000r/min，离心20min，分离贫血小板血浆（PPP）。

2.用PPP调整PRP中血小板数为200.0×109/L。

3.取PRP 0.6ml加入有刻度的小试管中，置37℃水浴3min后，再加入0.05mol/L氯化钙溶液或20U/ml凝血酶溶液0.2ml。混匀后，于37℃水浴2h，用竹签挑取血浆凝块，准确测量血清的体积（ml）。

4.计算

【注意事项】

1.温度须控制在37℃。

2.测定标本必须进行血小板数的调整。

【参考范围】血块收缩率>40%

【临床意义】

1.减低　见于血小板减少或功能异常，如ITP、原发性血小板增多症、血小板无力症、低（无） 纤维蛋白原血症等。

2.增高　见于纤维蛋白原增高和先天性因子Ⅻ缺乏症等。

（三）血小板黏附试验

【原理】血小板黏附试验（platelet adhension test，PadT）使用玻璃滤器法。血小板具有黏附异物表面的特性，一定量血液通过玻璃滤器，一定数量的血小板就黏附在玻璃上，故经过玻璃滤器后的血小板数减低，通过比较经过玻璃滤器前后的血小板之差，计算出血小板黏附百分率。

【器材】玻璃滤器、硅化或塑料注射器和试管。

【试剂】EDTA-Na2抗凝剂。

【操作】

1.静脉采血1.5ml。

2.立即将血滴入玻璃滤器漏斗内。

3.将最初滤过的4滴血液收集在含有0.5mgEDTA-Na2抗凝剂的试管中，立即混匀做血小板计数。

4.把注射器余下的血液加4滴于含有0.5mgEDTA-Na2抗凝剂的试管中，混匀做血小板计数，计数值为滤过前血小板数。

5.计算

【注意事项】

1.顺利采血，避免产生气泡、溶血和凝血。采血的静脉不宜太粗以便控制血流速度。

2.检测前1周，禁服阿司匹林类药物。

【参考范围】（31.9±10.9）%。

【临床意义】

1.血小板黏附率减低　见于vWD、巨大血小板综合征、血小板无力症、肝硬化、尿毒症、服用血小板抑制药物等。

2.血小板黏附率增高　见于高凝状态和血栓性疾病，以及糖尿病、肾小球肾炎、口服避孕药、妊娠高血压疾病等。

（四）血小板聚集试验

【原理】血小板聚集试验（platelet aggregation test，PAgT）应用比浊法。在血小板聚集仪特定的连续搅拌条件下，在富血小板血浆中加入各种诱导剂。血小板发生聚集，PRP悬液浊度随之下降，光电池将光浊度的变化转换为电讯号，记录在记录纸上。根据描记曲线计算出血小板聚集的程度和速度，判断血小板聚集能力。

【器材】

1.血小板聚集仪和记录仪。

2.其他：血细胞计数板、显微镜、离心机及试管等。

【试剂】

1. 0.109mol/L枸橼酸钠溶液。

2.血小板聚集诱导剂：可选用下列任意一种：ADP、ATP、肾上腺素、胶原、瑞斯托霉素、花生四烯酸，常用为ADP诱导剂。

【操作】

1.静脉采血4.5ml，加0.109mol/L枸橼酸钠溶液0.5ml抗凝，分离富血小板血浆（PRP），和贫血小板血浆（PPP）。以PPP调整PRP血小板数至250×109/L。

2.按说明书操作血小板聚集仪

（1）接通聚集仪电源预热。

（2）接通记录仪电源。

（3）将被检者PPP和调整后的PRP各0.3ml分别加入到2只比色杯中，置于聚集仪上的温浴槽，温浴3min。

（4）将 PPP置于测定槽，调零。

（5）将调整后的PRP置于上述同一测定槽，加入搅拌珠，调至PRP吸光度为100%。

（6）搅拌10～20min，将1/10体积的诱导剂加入PRP中，启动反应按钮。

（7）记录仪记录5min反应过程的变化特点。

【注意事项】

1.样本采集：要求空腹采血，试验前1周禁服阿司匹林等抑制血小板聚集的药物。

2.按照离心条件制备PRP，离心力过高会使血小板下沉，尤其是体积大的血小板，后者的聚集反应性往往较强。另外避免红细胞混入、溶血等现象。

3. PRP制备30min内不能进行测定，此时的血小板聚集反应性差。

4.标本采集后应放置在15～25℃，3h内完成检测。

5.如需进行多种诱聚剂测定，应优先进行花生四烯酸和瑞斯托霉素聚集试验。

【参考范围】不同仪器、不同聚集剂的浓度和剂量，有不同的参考值。以MG-196型血小板聚集仪为例，其参考值和参数分析见表16-4。

表16-4　血小板聚集试验的参考值

【临床意义】

1.增高　见于血栓前状态和血栓心性疾病、高β-脂蛋白血症、糖尿病等。

2.减低　见于血小板无力症、巨大血小板综合征、血小板贮存池病、肝硬化、尿毒症等。

（五）血小板相关抗体检测

【原理】血小板相关抗体检测（platelet associated antibody，PAIg）使用双抗夹心ELISA法。以PAIgG为例，将抗人IgG抗体包被在酶标反应板孔内，加入待检血小板溶液中的IgG与之结合，再加入酶标记的抗人IgG抗体，形成抗人IgG抗体-PAIgG-酶标抗人IgG抗体复合物，洗涤后加入底物显色，颜色深浅与血小板PAIgG含量成正比，根据测得的吸光度值A，从标准曲线中计算血小板溶液中PAIgG的含量。

【操作】

1.血小板溶解液制备：静脉血4.5ml加5%EDTA-Na20.5ml抗凝，以1000r/min离心8min，取上层PRP，PRP再以3000r/min离心20min，弃去上清液，留取血小板；用血小板洗涤液洗涤3次，用缓冲液调整血小板浓度为100×109/L。用11%TritonX-100按1:10（V/V）加入血小板悬液中（终浓度为1%）使血小板溶解，置于4℃30min后，转速3000r/min，离10min，取上清液测定。

2.按照试剂盒说明和要求操作：包被、加样、酶标抗体、显色、终止、制作标准曲线，参见vWF检测。

3.酶标仪于492nm处测吸光度（A值），从标准曲线中可查出被检样本吸光度所对应浓度，结果以ng/107血小板表示。

【注意事项】

1.分离血小板尽可能地避免红细胞和白细胞的掺入。

2.血小板溶解液可贮存在 -20℃，1周内测定。

3.注射器和试管必须涂硅或用一次性塑料制品，以减少血小板激活。

4.标准曲线及待测标本均做两孔，取平均值。如两孔A值相差>0.1，均应重测。

5.试验前2周停用皮质激素。

【参考范围】 PAIgG：0～78.8ng/107血小板，

PAIgM：0～7.0ng/107血小板，

PAIgA：0～2.0ng/107血小板，

PAC3：0～18.0ng/107血小板。

【临床意义】作为ITP诊断指标之一。90%以上ITP患者的PAIgG增高，如果患者PAIgM、PAIgA和PAC3也同时阳性可以确诊ITP。ITP患者经激素治疗有效，则PAIgG水平下降。如PAIgG在2周之内下降者其预后较好。但血小板相关抗体阳性，也可见于SLE、慢性活动性肝炎、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、Evans综合征等。

（六）血小板第3因子有效性检测

【原理】血小板第3因子有效性检测（platelet factor 3 availability test，PF3aT）是将正常人、患者富血小板血浆（PRP）和贫血小板血浆（PPP）交叉配合，以白陶土作为血小板激活剂，血小板活化后，膜内的磷脂酰丝氨酸转向膜外，形成PF3，参与血浆凝固。再测定各组血浆凝固时间，比较各组凝固时间长短，从而得知PF3是否有缺陷。

【试剂】

1.0.109mol/L枸橼酸钠溶液。

2.0.025mol/L氯化钙溶液。

3.40g/L白陶土悬液：取白陶土4g，加入100ml生理盐水中。

4.血小板稀释液：同血小板计数。

【操作】

1.患者和正常对照分别静脉采血2.7ml，置于塑料试管，0.109mol/L枸橼酸钠0.3ml抗凝，制备富血小板血浆（PRP） 和贫血小板血浆（PPP）血浆。

2.分别计数患者与正常对照者的PRP血小板数，并用自身的PPP调整血小板数到250×109/ L，PPP的血小板要求调整到20×109/L以下。

3.取8支小试管分为4组，每组2支，按表16-5操作。

4.将上述8支试管置37℃水浴2min，从第1支起依次每隔2min加入白陶土悬液0.2ml。记录加入白陶土的时间，其间摇动数次。

表16-5　PF3aT的测定操作程序

5.20min后各管依次加入0.2ml氯化钙溶液，同时立即开动秒表，将试管浸入37℃水浴中，不断轻轻摇动，约30s时取出试管观察，准确记录凝固时间。

【注意事项】

1.患者和正常对照同时采血，并必须顺利，避免溶血和凝块。

2.注意血液与抗凝剂的比例，对严重贫血或血细胞比容明显增高的血液应调整抗凝剂的用量，调整公式为：抗凝剂（ml）＝（100-Hct）×血液（ml）×0.00185。

3.血小板悬液避免混入红细胞。

【参考范围】第1组比第2组的结果延长超过5s，则为PF3aT有效性减低。

第3组与第4组为对照，如果血友病时第3组也会延长。

【临床意义】PF3aT减低：见于先天性血小板第3因子缺乏症、血小板无力症、巨大血小板综合征、血小板减少症、DIC及肝硬化等。

（七）血小板膜糖蛋白检测

【原理】用流式细胞术检测。将抗人血小板糖蛋白抗体与血小板膜糖蛋白结合，再加入标有荧光的鼠抗人血小板糖蛋白单克隆抗体，形成复合物，流式细胞仪检测。血小板表面糖蛋白含量与检测荧光强度成正比。

【临床意义】GPⅡb／Ⅲa缺乏见于血小板无力症。GPIb、GPV、GPⅨ数量减少或缺陷，见于巨大血小板综合征。

（八）β-血小板球蛋白检测

【原理】用双抗体夹心ELISA法。选抗β-TG包被酶标反应板，与待检血浆中β-TG抗原特异性结合，再加入酶标抗β-TG抗体，加入底物与酶反应显色，其显色与待检血浆β-TG抗原量成正比。

【操作】

1.标本制备：取5%EDTA-0.27%茶碱抗凝剂0.28ml于塑料试管中。用8号针头采血5ml，弃去最初的2ml后，自然滴血约2.5ml于抗凝剂的试管（以血液与抗凝剂V/V9:1抗凝）。轻轻混合即刻置于冰水浴，4℃转速3500r/min，离心30min，吸取上层血浆置于低温冰箱。

2.包被、加样、酶标抗体、显色、终止、制作标准曲线，参见vWF检测。

3.计算：酶标仪上492nm比色，测定吸光度A，然后从标准曲线上读出样品测定的数值。

【注意事项】使用适当的含血小板抑制剂的抗凝剂，防止血小板发生体外活化而释放β-血小板球蛋白，引起结果偏高。

【参考范围】血浆β-TG：6.6～26.2μg/L。

【临床意义】增高：见于血栓前状态和血栓性疾病，反映血小板被激活及其释放。先天性或获得性贮存池病，血小板大量被破坏或消耗。β-TG主要经肾排泄，尿毒症等肾功能障碍时，β-TG明显升高。

（九）P-选择素检测

【原理】用免疫荧光法。以异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗P-选择素抗体，与血小板膜表面P-选择素特异性结合，结合在血小板膜上的异硫氰酸荧光素的量与血小板膜表面P-选择素呈正相关，通过检测荧光强度，计算待检测血小板膜表面P-选择素的含量。

【器材】血细胞计数板、显微镜、荧光分光光度计。

【试剂】

1.抗凝剂：5%EDTA-Na2抗凝剂。

2.4%多聚甲醛。

3.血小板洗涤液。

4.抗血小板膜表面P-选择素单克隆抗体试剂盒。

【操作】

1.标本采集：0.2ml5%EDTA-Na2置于硅化管中，患者空腹静脉采血1.8ml，轻轻混合，转速1000r/min，离心10min，分离PRP后立即与4%多聚甲醛等体积混合后置于室温30min。

2.用血小板洗涤液洗涤上述悬液3次。再用洗涤液调整血小板浓度为1.0×109/L。

3.取血小板悬液lml，加入抗血小板膜表面P-选择素单克隆抗体（使悬液浓度65μg/ ml），混匀后置于室温30min，再用洗涤液洗涤2次，加2ml洗涤液悬浮血小板。

4.在上述血小板悬液中加10μl FITC标记的羊抗鼠IgG抗体，避光置于室温下20min，用洗涤液洗涤2次，重新悬浮于0.01mol/LPBS中，调整血小板浓度为250×109/L。

5.用0.01mol/LPBS配制标准异硫氰酸荧光素溶液。

6.非特异性结合对照管：未加抗血小板膜表面P-选择素单克隆抗体管作为非特异性结合对照管。

7.用荧光分光光度计测定荧光强度

8.计算

（公式中：IgG相对分子质量为165000，其摩尔浓度在1M的分子数为6.023×1023。当FITC与抗体分子以1:1结合时，根据B值换算血小板表面P-选择素分子数）。

【注意事项】

1.血小板计数必须准确。血小板洗涤过程避免产生气泡而激活血小板。

2.操作过程的环境温度为25℃适宜。

【参考范围】（7900～10100）分子数/血小板。

【临床意义】血小板表面P-选择素分子数表达增强表明血小板激活，是血小板活化的特异分子标志物之一。增高见于血栓性疾病、DIC以及糖尿病、妊娠高血压疾病和恶性肿瘤等。

（十）血浆血栓烷B2（TXB2）检测

【原理】用[125I]-标记测定法。将TXB2和络氨酸甲酯（TME）反应结合形成TME-TXB2，然后用［125I］进行标记，形成［125I］-TME-TXB2示踪剂。待检样品中TXB2和成品125I-TMETXB2与限量抗体共同竞争结合，从校正曲线上查出待检样品中TXB2的浓度。

【器材】自动γ免疫计数器。

【试剂】

1.示踪剂[125I]-TME-TXB2工作液，临用前以PBS稀释至100μl约1000cpm。

2.抗血清：用前稀释至100μ1，结合[125I]-TME-TXB21000cpm35%～40%为工作滴度。

3.分离剂：取100～120目的药用炭2g，右旋糖酐-70 0.4g于100mlPBS中，磁力搅拌20min。

4.标准TXB2工作液。

【操作】

1.血浆制备：塑料空针内预先加入吲哚美辛-肝素液0.1ml，静脉采血3ml，混匀，4℃转速3500r/min，离心20min，分离血浆，-20℃以下保存。

2.取10mm×100mm塑料管，总计数管（T）加PBS0.7ml，非特异结合管（NSB）加PBS 0.2ml，零标准管（S0）加PBS0.1ml，校正曲线管（S1～7）加入不同浓度的标准液。

3.每管各加[125I]-TME-TXB2工作液0.1ml。除T和NSB管外，其余加抗血清0.1ml；混匀放2～4℃，12～16h。

4.除T管外，各加分离剂0.5ml，充分混合，放2～4℃ 20min。离心，转速3500r/min（4℃）15min。将上清液全部倾入另一管中，在自动γ免疫计数器上测放射性。

5.以B/B0%为纵坐标，标准管TXB2浓度为横坐标，在半对数纸上制校正曲线。依样品管的B/B0值从校正曲线上查出TXB2浓度，再换算成ng/L。

【参考范围】男性（130±38）ng／L，女性（136±5l）ng／L。

【注意事项】

1.[125I]-TME-TXB2保存在无水乙醇中，6个月后仍有较高免疫活性。

2.血浆中的蛋白质和脂肪酸对测定有明显干扰，故样品必须提取和纯化。

【临床意义】TXB2增高见于血栓前状态和血栓病、糖尿病等。减低见于服用阿司匹林等非甾体类抗炎药物，或先天性血小板环氧化酶缺陷。