本研究以芦丁为观测指标，以NaNO2－Al（NO3）3－NaOH为显色体系，应用差示分光光度法的原理，以碱性供试品溶液为参比，消除了样品中在碱性条件下吸收带的红移所产生的对中药材中总黄酮含量测定的干扰，建立了中药材猫爪草中总黄酮含量的测定方法。结果显示，不同产地总黄酮的含量有所不同，与产地有关。本法操作简便，结果可信，重现性好，方法学验证表明，本方法符合含量测定要求，可考虑用作控制猫爪草药材质量的分析方法。
1．仪器、试剂与药材
（1）仪器：UV－2401分光光度计（日本岛津）。
（2）试剂：亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙醇均为分析纯；芦丁对照品由中国生物制品检定所提供，批号0080－9705，含量测定用。
（3）药材：猫爪草购于河南信阳、安徽亳州等地，有野生和种植品种。
2．方法
（1）对照品溶液的制备：取经干燥的无水芦丁对照品约12mg，精密称定，置于100ml容量瓶中，用70%乙醇稀释至刻度，摇匀即得浓度为12．81mg／ml的对照品储备液（Ⅰ）。
（2）供试品溶液的制备：取药材粉末（过60目筛）0．6g，精密称定，置150ml烧瓶中，精密加入70%乙醇20．00ml，称重。回流90min，冷却，称重，补足重量，滤过，弃前滤液2ml，接收续滤液，即得供试品贮备液（Ⅱ）。
（3）显色反应及测定方法：精密量取同一供试品溶液2份，每份5ml，分别置于10ml量瓶中，其中一份加入5%NaNO2溶液0．3ml，充分摇匀，反应6min后，加入10%AI（NO3）3溶液0．35ml，充分摇匀，再反应6min后，加入1mol／L NaOH溶液4．0ml，加蒸馏水稀释至刻度，充分摇匀，反应6min后，按《中国药典》2005版一部附录ⅤA紫外－可见分光光度法，以另一份加入1mol／L NaOH溶液4．0ml，加蒸馏水稀释至刻度的溶液作为参比，在510nm波长下测定吸光度。
（4）参比溶液的选择：以经典的测定总黄酮的方法，即以试剂空白溶液为参比，在400～800nm间进行光谱扫描，结果显示显色的样品溶液在510nm处成肩峰状态。分别将显色对照品、样品溶液以对应的碱性对照品、样品溶液为参比溶液，在400～700nm间进行光谱扫描，结果显示在510nm处都有最大吸收，表明可选择以对应的碱性供试品溶液作为参比溶液。
（5）工作曲线及线性范围：精密量取对照品储备液（Ⅰ）0．5ml，1．0ml，2．0ml，3．0ml，4．0ml，5．0ml，分别置于10ml容量瓶中，加入70%乙醇使成5ml，按（3）项下的方法，自“加入5%NaNO2溶液0．3ml”起，依法操作。以差示吸光度（ΔA）为纵坐标以对照品溶液的浓度（μg／ml）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程：ΔA＝0．0120C－0．0039（n＝2），r＝0．9999。
（6）精密度、重复性、稳定性试验：取（5）项下的第4点溶液连续重复测定吸光度6次，计算得RSD为0．25%，表明仪器精度良好。取药材（M6）粉末6份，按（2）和（3）项下的方法操作，测定药材中总黄酮的含量，所得重复性试验的RSD为1．34%。对其中的“M6－1”溶液在60min内测定吸光度，RSD为2．22%，表明供试液中芦丁在60min内稳定性良好。
（7）加样回收率试验：取药材（M6）粉末（以无水芦丁计总黄酮含量为0．228%）0．3g，共6份，精密称定，置150ml烧瓶中，分别精密加入浓度为32．02μg／ml的芦丁对照品溶液20．00ml，按（2）项下的方法，自“回流90min”起进行操作后，以（3）项下的方法进行操作测定。加样回收率试验表明芦丁平均回收率为98．85%，RSD＝1．29%。
3．结果 对6份不同药材样品中总黄酮依法测定含量，结果不同产地总黄酮的含量有所不同，与产地有关，见表2－4。
表2－4 样品测定结果（n＝3）
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