生物碱类成分的体内药物分析

10.2.2.1　生物碱类化合物的结构与性质

生物碱(alkaloids)是一类重要的中药成分，是含负氧化态氮原子、存在于生物有机体中的环状化合物。生物碱成分主要分布在植物性中药中，在动物性来源的中药中生物碱类成分很少。许多重要的植物性中药如鸦片、麻黄、汉防己、莨菪、延胡索、苦参、洋金花、番木鳖、秋水仙、长春花、三尖杉、乌头(附子)、黄连、黄柏等主要含有生物碱类成分。例如，黄连含有小檗碱、黄连碱、巴马汀、表小檗碱、药根碱、木兰花碱和甲基黄连碱等生物碱类成分，是黄连的主要有效成分。

根据分子中氮原子所处的状态，生物碱的存在形式分为6种:游离碱、盐类、酰胺类、N－氧化物、氮杂缩醛以及其他类如亚胺、烯胺等。有些生物碱以游离形式存在，如咖啡碱和秋水仙碱等。绝大多数生物碱是以盐的形式存在，形成盐的酸主要有草酸、柠檬酸、硫酸、盐酸、硝酸等。有些生物碱能与糖结合，以苷的形式存在。

生物碱种类繁多，按母核的基本结构分为60类左右，主要包括12类，即有机胺类(如麻黄碱)、吡咯烷类(如千里光碱)、吡啶类(如苦参碱)、喹啉类(如喜树碱)、异喹啉类(如小檗碱)、喹唑酮类(如常山碱)、吲哚类(如长春碱)、莨菪烷类(如莨菪碱)、亚胺唑类(如毛果芸香碱)、嘌呤类(如茶碱)、甾体类(如贝母碱)、萜类(如乌头碱)等。大多数生物碱为结晶状固体，少数为液体。一般生物碱无色，少数具有颜色，如小檗碱呈黄色。大多数生物碱具有不对称碳原子，所以具有旋光性，且大多数生物碱具有左旋光性。大多数生物碱具有碱性，其碱性强弱与分子中的氮原子的存在状态密切相关，一般是季胺碱＞叔胺碱＞仲胺碱。若氮原子呈酰胺状态，则碱性极弱甚至消失，如胡椒碱。少数生物碱分子具有酚羟基或羧基，因而具有酸碱两性，如槟榔次碱。

游离生物碱极性较小，不溶或难溶于水，能溶于三氯甲烷、乙醚、丙酮、乙醇、苯、甲醇等有机溶剂，也能溶于稀酸的水溶液而生成盐类。生物碱盐类易溶于水和乙醇，不溶或难溶于有机溶剂。但也有一些例外，如麻黄碱和秋水仙碱均可溶于水，也可以溶于有机溶剂;小檗碱可溶于水，其盐在冷水中反而不溶;含酚羟基生物碱可溶于氢氧化钠溶液。所有季铵盐生物碱由于能离子化，亲水性强，能溶于水。生物碱的酸碱性和其溶解性质对于建立生物碱的体内分析方法具有重要意义。

10.2.2.2　生物碱类成分的体内分析方法的建立

要研究黄酮类成分在机体中的体内过程(即药代动力学行为)，首先要建立生物碱类成分的体内分析方法。常用于生物碱类成分的体内分析方法主要有高效液相色谱法、高效液相色谱－质谱联用技术(LC－MS法)以及高效毛细管电泳法等。建立生物碱类成分的体内分析方法，根据研究对象(即要测定的成分)在生物样品中的浓度(有的生物碱在体内浓度非常低，一般方法难以测定)以及实验室的条件，结合要测定的生物碱类化合物的结构特点，具体问题具体分析，选择合适的体内样品测定方法。

1.高效液相色谱法

(1)概述:生物碱类成分采用高效液相色谱法进行体内分析时常用反相高效液相法，而且由于生物碱类化合物常常具有一定的碱性，因此常采用离子对高效液相色谱法或离子抑制色谱法。采用高效液相色谱法进行生物碱类成分的体内分析时，对生物样品的处理有蛋白沉淀法、液液萃取法、固液萃取法等。选用什么样的生物样品处理方法要根据生物样品里面的生物碱成分的化学性质，具体问题具体分析。例如，有的生物样品中待测生物碱类成分浓度较高，且待测物在水中有一定的溶解度，则可以采用蛋白沉淀法。至于采用何种沉淀剂，也要根据待测生物碱成分的化学性质确定。

(2)应用实例

实例:反相高效液相色谱法快速测定大鼠血浆中的槐定碱的浓度

槐定碱(sophoridine，SRI)是苦豆子(Sophora alopecuroides L.)的一种主要成分，药理学研究表明槐定碱具有抗心律失常、抗肿瘤、免疫增强、杀菌和中枢神经兴奋作用，其结构见图10－6。为了研究槐定碱经胃肠道给药后其体内过程，Wei等采用麻黄碱作内标，建立了一种快速测定大鼠血浆中槐定碱(SRI)浓度的高效液相色谱法。

①色谱条件:采用岛津LC－20A HPLC系统，色谱柱为YMC ODS柱(4.6 mm×150 mm，5μm，日本YMC公司)，流动相为甲醇－乙醇－0.1 mol·L－1醋酸铵缓冲液－三乙胺(10 0.5 89.5 0.03，v/v)。流动相的pH以冰醋酸调节至6.8。流动相临用前以0.45 μm滤膜过滤。流速为0.8 mL·min－1，检测波长为210 nm，柱温为室温，进样体积20μL。

②样品处理:0.1mL的血浆样品加入0.2mL的乙腈和内标(10μg·mL－1)，涡旋混匀30s，放置10 min，然后以10800 rpm离心5 min以分离蛋白沉淀。上清液转移到含有40～50 mg的氯化钠和10～20 mg的碳酸钠的离心管中。涡旋混匀放置10 min，然后以10800 rpm再离心5min，取上清液20μL直接进样分析。回收率和精密度研究的样品处理过程与此相同。

③标准曲线:通过将SRI与内标的峰面积比对SRI的浓度作图，建立了SRI浓度范围为0.5～70 mg·L－1的标准曲线。为了避免过度的偏差，标曲按两部分浓度范围即0.5～5 mg·L－1和5～70 mg·L－1建立。最小二乘法分析用于确定标曲的斜率、截距和相关系数。结果获得的标曲为:Y=13.1X+0.158(0.5～5 mg·L－1)和Y=10.2X+1.953(5～70 mg·L－1)，Y为SRI与内标的峰面积比，X为SRI的浓度，相关系数r2=0.9995。

④专属性:方法的专属性通过考察空白血浆中的内源性成分是否干扰SRI的分离测定来评价。在上述色谱条件下，血浆中的内源性成分不干扰SRI和内标(IS)的分离，代表性的色谱图见图10－7。SRI和内标的保留时间分别约为5.6 min和7.9 min。通过对流动相的组成、流动相的pH、流速和加入修饰剂等条件的优化，使SRI、内标、血浆中的内源性杂质之间得到很好的分离。最初采用甲醇－水(13 87)作为流动相，结果不太理想。为了改善峰形以及SRI和IS的分离，加入了0.5%的乙醇。为了获得良好的基线稳定性，水相以0.1 mol·L－1醋酸铵缓冲液代替。为了改善峰形拖尾，加入了修饰剂三乙胺，其最佳比例为0.03%，流动相的流速为0.8 mL·min－1。本法的样品处理过程简单，即碱化提取(加入碳酸钠作为碱化剂)。

⑤精密度和最低定量限(LOQ):空白血浆加入SRI标准品配制成浓度为0.5 mg·L－1、1.0 mg·L－1、5.0mg·L－1、10.0mg·L－1、20.0mg·L－1、35.0mg·L－1和70.0mg·L－1的模拟生物样品(每个浓度6份)，按上述方法处理并进行测定，计算相对标准差(RSD)即精密度。结果表明各浓度日内精密度(RSD)＜7%，日间精密度(RSD)＜10%。

LOQ的测定:将测定标曲时的SRI浓度为1.0 mg·L－1的模拟生物样品用空白血浆稀释能浓度为0.1mg·L－1、0.15 mg·L－1、0.2 mg·L－1、0.3 mg·L－1、0.4 mg·L－1的样品，测定LOQ。结果表明LOQ为0.15 mg·L－1。

⑥回收率:将SRI标准品加入乙腈或空白血浆中，分别配制5个浓度(1.0 mg·L－1、5.0 mg·L－1、10.0 mg·L－1、35.0 mg·L－1和70.0 mg·L－1)的乙腈和血浆样品。血浆样品按上述方法处理，乙腈样品直接测定。回收率=［(血浆样品的SRI与IS的峰面积比)/(乙腈样品中的SRI与IS的峰面积比)］×100%。结果表明这5个浓度的回收率为87.61±1.58%～95.00±2.95%。

图10－6　槐定碱的结构

图10－7　代表性色谱图

(a)空白血浆;(b)空白血浆加SRI和IS标准品;
(c)大鼠灌胃给予SRI水溶液后的血浆样品。SRI和IS的保留时间分别为5.6 min和7.9 min

2.液相色谱－质谱联用技术

(1)概述:很多生物碱类成分如小檗碱、黄连碱、药根碱等在肠道吸收很少，体内浓度很低，常规高效液相色谱法难以满足其测定要求，而LC－MS由于具有高灵敏度，能满足生物碱类成分的体内测定要求。

生物碱类成分的LC－MS分析方法的建立从三方面着手。①对于生物碱类成分的生物样品的处理，其一般样品处理的注意事项见前面高效液相色谱法建立中的样品处理。在生物碱类成分的LC－MS法的建立中，由于一般沉淀去蛋白法有较多的缺点，如不容易将生物样品基质中引起基质效应的成分去除掉，因此蛋白沉淀法较为少用。在LC－MS法的样品处理中，液液萃取和固相萃取更为常用。有关液液萃取和固相萃取的具体方法见前面有关章节。②在生物碱类成分的LC－MS方法建立的液相色谱条件的选择环节，和前述高效液相色谱法的类似，注意生物碱类成分由于具有一定的碱性，因此要注意调整流动相的pH。总体来讲，由于LC－MS法中检测的是分子量，因此，LC－MS的色谱条件的选择比单纯的高效液相法中的色谱条件的选择要简单、容易，但要注意流动相中避免使用难挥发的无机酸和无机盐类。在生物碱类成分的LC－MS测定的色谱条件中，与生物碱类成分的高效液相色谱分析条件有些差别，如一般不加入离子对试剂。③生物碱类成分LC－MS分析的质谱条件的选择，包括离子源、分析模式、气体流速、锥体电压、离子源温度等等。由于生物碱类成分具有一定的碱性，极性较高，常选用ESI离子源。当然，针对不同的生物碱类化合物，根据具体情况选用合适的离子源。生物碱类成分由于有一定的碱性，更容易带上正电荷。因此，在生物碱类成分的LC－MS分析中常用正离子模式。其余质谱分析参数如气体流速、锥体电压、离子源温度等根据待测物的不同在实验中进行优化。

(2)应用实例

实例:LC－MS及固相萃取法测定犬血浆中巴马汀的含量

巴马汀(Palmatine)是一种季铵型异喹啉生物碱(结构见图10－8)，存在于黄连、黄藤、黄柏等中。研究表明巴马汀具有杀灭细菌、真菌和病毒的作用，还有血管舒张、镇静、抗肿瘤和肝保护作用，广泛用于治疗各种炎性疾病如细菌性痢疾、肠炎、呼吸道感染和尿道感染等。由于巴马汀在体内浓度较低，Huang等以药根碱为内标，采用固相萃取对样品进行处理，建立了LC－MS－MS测定犬血浆中巴马汀浓度的方法。

图10－8　巴马汀的结构

①LC–MS–MS条件:色谱分离采用Waters XTerra MS C18反相柱(5μm，50 mm×2.1 mm)，并加XTerra C18保护柱(5μm，10mm×2.1mm)。柱温30℃。流动相组成为:A为0.1%醋酸(三乙胺调pH至2.8)，B为乙腈。采用梯度洗脱，洗脱程序为(B%):0～1.0 min，20%～65%;1～2.5min，65%;2.5～2.6 min，65%～90%;2.6～4.0min，90%。自动进样器温度为4℃。

质谱条件:ESI选择正离子模式，氮气为雾化气和干燥气，CID选择氩气为碰撞气，源块温度100℃，脱溶剂温度450℃，去溶剂气流800 L·h－1，锥孔气60 L·h－1，碰撞气0.22 L·h－1，毛细管电压3.20 kV，锥孔电压50V，提取锥孔电压1.0 V，透镜电压0.8 V，放大器电压650V。巴马汀和内标药根碱的碰撞能分别为25 eV和30 eV。定量采用多反应监测(MRM)模式，巴马汀和内标药根碱的母离子→产物离子跃迁(m/z)分别为352→336和338→322(见图10－9)，采样时间为200ms。选择正离子扫描模式，巴马汀和内标都能获得最大丰度的母离子，且母离子的m/z等于其分子量。巴马汀的产物离子丰度较大的有m/z为337和336的两种，之所以选择m/z为336的产物离子作为定量标准，是因为m/z为337的产物离子不稳定。同样理由，内标药根碱的产物离子选择m/z为322。

②标曲样品和质控(QC)样品的制备:分别将巴马汀和内标药根碱溶于甲醇－水(50 50，v/v)制备浓度约为1 g·L－1的储备液。分别将巴马汀和内标药根碱的储备液用水稀释分别制备巴马汀和药根碱的标准工作液。内标(IS)药根碱工作液的浓度为100μg·L－1。所有的储备液和工作液均保存于4℃，临用前恢复至室温。标曲样品和QC样品通过将10μL标准工作液加入到100μL空白血浆中制备而成。

③样品处理:100μL血浆样品加入50μL内标工作液和0.5 mL磷酸盐缓冲液(0.05 M，pH 7.2)，涡旋混匀30s，混合物转移到Oasis HLB固相小柱，固相小柱分别先用1mL乙腈、1 mL水和1mL磷酸盐缓冲液(0.05 M，pH 7.2)进行预处理。上样后，小柱分别用1mL水和1 mL30%甲醇洗涤，并用空气对小柱进行净化直至洗涤溶液挥发干净。而后，用0.8 mL乙腈－浓盐酸混合溶剂(99.5 0.5，v/v))将小柱上的巴马汀和内标洗脱下来。洗脱液在40℃氮气吹干，残渣用100μL乙腈－0.1%醋酸混合溶剂(8 2，v/v)复溶，取10μL注入LC－MSMS仪分析。

④标准曲线:在0.1～500μg·L－1范围内配制9个浓度点的标曲样品，按上述方法进行样品处理和测定，以巴马汀与内标药根碱的峰面积比对巴马汀的浓度作图建立标曲。以权重(1/X2)最小二乘法回归分析获取标曲方程，如果相关系数低于0.990，则重复以权重回归分析以获得满意的标曲方程。结果得到标准曲线方程为Y=0.0059(±0.0011)X+0.0013(±0.0006)，r为0.9904～0.9984。其中Y为峰面积比，X为巴马汀的浓度。未知浓度的样品的巴马汀浓度由标曲计算得到。

图10－9　巴马汀和内标药根碱的结构和产物离子的质谱

⑤专属性:采用MRM模式对于测定犬血浆中的巴马汀能获得较好的选择性，其他成分不干扰测定。代表性的MRM色谱图见图10－10。巴马汀和内标的保留时间约为3.7 min和2.4 min。巴马汀和内标之间也没有串扰。

图10－10　代表性的MRM色谱图

(a)空白犬血浆样品;(b)空白血浆加巴马汀和内标标准品;(c)犬口服给予巴马汀后的血浆样品;
峰1—巴马汀，峰2—内标

⑥准确度和精密度:通过分析QC样品(0.1μg·L－1、0.5μg·L－1、10μg·L－1、500μg·L－1，每个浓度5份)进行准确度和精密度评价。日内精密度通过在一天内测定4个浓度的QC样品进行评价，日间精密度通过在连续5天测定4个浓度的QC样品进行评价。这些参数用来评价建立的方法的性能以及方法的定量下限(LLOQ)。定量上限(ULOQ)为标曲的定量范围的最高浓度。准确度以相对回收率(R)表示，精密度以相对标准差(RSD)表示。R=100×(测定浓度/配制浓度)。结果表明巴马汀的日内精密度(RSD)为2.7%～9.5%，日间精密度(RSD)为6.2%～9.9%。日内相对回收率(R)为87.3%～100.9%，日间相对回收率为87.1%～89.1%。LLOQ为0.1μg·L－1，ULOQ为500μg·L－1。

⑦提取回收率和基质效应:提取回收率和基质效应的测定通过测定下面3批样品进行评价:第1批为巴马汀和内标的标准溶液。第2批为血浆提取溶液加巴马汀和内标配制的样品。第3批为血浆加巴马汀和内标配制的QC样品，然后按前述样品处理方法进行处理。每批样品含4个浓度(0.1μg·L－1、0.5μg·L－1、10μg·L－1、500μg·L－1)。通过比较第1～3批样品中分析物的峰面积，计算提取回收率和基质效应。巴马汀和内标的提取回收率计算:提取回收率(%)=100×(第3批样品中分析物峰面积/第2批样品中分析物峰面积);巴马汀的基质效应计算:基质效应(%)=100×(第2批样品巴马汀的峰面积/第1批样品中巴马汀的峰面积)。结果表明，巴马汀4个浓度(0.1μg·L－1、0.5μg·L－1、10μg·L－1、500μg·L－1)的QC样品的提取回收率分别为96.2%、95.9%、103.3%、101.5%。平均提取回收率为99.2%。内标药根碱的平均提取回收率为96.8%。所有回收率的RSD均小于9.6%。巴马汀4个浓度(0.1 ng·mL－1、0.5 ng·mL－1、10 ng·mL－1、500 ng·mL－1)的QC样品的基质效应分别是103.1%、94.4%、101.8%和99.0%，表明血浆提取物中没有或没有可检测到的影响巴马汀离子化的成分。

⑧稳定性:通过测定0 h和24 h样品的浓度变化，对复溶样品在自动进样瓶(4℃)中的稳定性进行了评价。巴马汀血浆样品短期稳定性则通过测定QC样品室温放置2h浓度的变化进行评价。通过分析巴马汀4个浓度(0.1μg·L－1，0.5μg·L－1，10μg·L－1，500μg·L－1)的QC样品在第1天和第15天的浓度变化对巴马汀血浆样品的冻融循环稳定性(－20℃)进行评价。结果表明，复溶样品在自动进样瓶(4℃)中至少24 h内稳定。巴马汀血浆样品室温放置2 h和经过3个冻融循环及－20℃储存15天是稳定的。