原位基本原理

原位PCR技术是通过PCR扩增使目的核酸片段拷贝数组织原位在细胞增加,再通过核酸原位杂交方法检测靶核苷酸的技术,其PCR扩增与液相PCR扩增的原理相同,即在耐热的DNA聚合酶作用下,以三磷酸核苷酸(d NTP)为原料,以合成的DNA片段为引物,以待检核酸片段为模板,经过高温变性、低温退火、中温延伸的循环过程,指数扩增特定的靶核苷酸片段。待检核酸为DNA,则以DNA为模板扩增,称为原位PCR;待检核酸为RNA,则以RNA为模板扩增,称为原位反转录PCR。检测DNA的方法包括:直接法原位PCR和间接法原位PCR;检测RNA的方法包括:原位反转录PCR和原位再生式序列复制反应。

(一)直接法原位PCR

1.基本原理 在反应体系中加入特异标记的d NTP或引物(常用标记物有地高辛、生物素、荧光素、核素标记等),在标本PCR扩增时,标记分子掺入扩增产物,扩增产物即可被直接观察,无需再行原位杂交。

2.特点 操作简便、流程短、省时,但特异性差、扩增效率低、组织切片DNA损伤较重、假阳性率较高。

3.反应过程

(1)标本固定。

(2)蛋白酶处理。

(3)PCR扩增(反应体系的d NTP或引物携带标记物)。

(4)产生含标记分子的扩增产物。

(5)依据标记分子类型选用相应方法检测。

(二)间接法原位PCR

1.基本原理 反应体系中的d NTP和酶均不进行特殊标记,直接进行PCR反应,扩增目的片段,然后用特异性标记探针与扩增产物进行原位杂交。

2.特点 特异性强,应用范围广,但操作相对复杂,费时。

3.反应过程

(1)、(2)同直接法原位PCR。

(3)PCR扩增(不带任何标记物)。

(4)用探针标记原位杂交检测特异性扩增产物(产生带有标记分子的杂交体)。

(5)原位检测杂交信号。

(三)原位反转录PCR

1.基本原理 原位反转录PCR是将反转录反应和PCR相结合,以检测细胞内低拷贝的m RNA。它先以m RNA为模板,在反转录酶催化下合成cDNA,再以cDNA为模板,用PCR法对靶序列进行扩增,最后用特异性探针进行原位杂交。

2.特点 无需从标本中提取m RNA,在固定的组织或细胞标本上定位检测m RNA。

3.反应过程

(1)、(2)同直接法和间接法。

(3)DNA酶处理(破坏组织细胞中的DNA)。

(4)反转录反应(随机引物、d NTP、反转录酶,mRNA为模板42℃扩增cDNA)。

(5)PCR扩增特异cDNA片段。

(6)原位杂交检测。

(四)原位再生式序列复制反应(self-sustained sequence replication reaction,3SR反应)

1.基本原理 本反应以mRNA为模板,通过反转录酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶的作用,以RNA/cDNA和双链cDNA为中间体,直接扩增RNA靶序列,是一种特殊基因序列扩增技术。

2.特点 需要3种工具酶,即AMV反转录酶、大肠埃希菌RNA酶H和T7RNA聚合酶;引物5’端有T7RNA聚合酶启动子;扩增反应在42℃下进行2h,不需要热循环。

3.反应过程 依次为:标本固定、脱水干燥、3SR反应及原位杂交检测。