引物设计的基本工作原则

实验流程_分子生物学实验手

PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。通过不断重复这一过程，可以使目的DNA片段得到扩增。另一方面，新合成的DNA片段也可以作为模板，因而PCR技术可使DNA的合成量呈指数型增长。

PCR技术实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR的特异性取决于引物和模板的特异性结合。

PCR反应分为3个步骤。

（1）变性（denaturation）：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离成单链DNA。

（2）退火（annealing）：当温度降低时由于模板分子结构较引物复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少。

（3）延伸（extension）：在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在的条件下，5'→3'的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。

以上3个步骤为一个循环。每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，数小时以后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达2×106～7拷贝。

如图7-1所示，经过高温变性、低温退火和中温延伸3个温度的循环，模板上介于2个引物之间的片段不断得到扩增。每循环一次，目的DNA的拷贝数加倍，随着循环次数的增加，目的DNA以2n－2n的形式堆积。

图7-1 PCR原理示意图

在反应的最初阶段，原来的DNA担负着起始模板的作用，随着循环次数的递增，由引物介导延伸的片段急剧地增多而成为主要模板。因此，绝大多数扩增产物将受到所加引物5'末端的限制，最终扩增产物是介于两种引物5'末端之间的DNA片段。

PCR实验流程：

一、PCR引物的设计

引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。使用不合适的PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱……现在，PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件（具体可参见第5章相关内容）。

（一）引物设计的基本原则

1．引物与模板的序列要紧密互补。

2．引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构。

3．引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应（即错配）。

（二）具体因素

1．引物长度（primer length）。

2．产物长度（product length）。

3．序列Tm 值（melting temperature）。

4．引物与模板形成双链的内部稳定性（internal stability， 用∆G 值反映）。

5． 形成引物二聚体（primer dimer）及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值。

6．在错配位点（false priming site）的引发效率。

7．引物及产物的GC 含量（composition）。

8．必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。

（三）引物设计需遵循的一般原则

1．引物应在核酸序列保守区内设计并具有特异性 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（如DNAman）比对（alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。

2．产物不能形成二级结构 某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（如RNA structure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）＜58.6l kJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2'-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

3．引物长度一般为15～30碱基 引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T），Ln值不能＞38，因为＞38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃），不能保证产物的特异性。引物过短也会使特异性降低。

4．引物GC含量在40%～60% GC含量过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。

5．Tm值最好接近72℃ 上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度一般高于Tm值5～10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55～80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

6．碱基要随机分布 引物中4种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3'端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区引发错误。

7．引物自身不能有连续4个碱基的互补 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构影响引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。

8．引物之间不能有连续4个碱基的互补 两引物之间不应存在互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应有多于4个连续碱基的同源或互补。

9．引物5'端可以修饰 引物的5'端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5'端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。

10．引物3'端不可修饰 引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。3'端也不能有形成任何二级结构的可能，除在特殊的PCR（allele-specific PCR, AS-PCR）反应中，引物3'端不能发生错配。

11．引物3'端要避开密码子的第3位 如扩增编码区域，引物3'端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。

（四）常用的引物设计软件

1．Primer Premier （自动搜索） 具体操作可参见第5章相关内容。

2．Oligo 6 （引物评价）

3．Vector NTI Suit

4．Dnasis

5．Omiga

6．Dnastar

7．Primer3（在线服务）

二、PCR反应体系

标准的PCR反应体系（50～100µl体积）如下。

（1）10×缓冲液

KCl　　　　　　　　　　　　　　　50mmol/L

Tris-HCl（pH 8.4～9.0）　　　10～25mmol/l

MgCl2 　　　　　　　　　　　　　1.5mmol/L

明胶或牛血清白蛋白（BSA）　　　　100µg/ml

注意：不同扩增模板或引物，其浓度有所差异，因此商家提供的缓冲液中一般不含MgCl2，另单独提供一管25 mmol/L MgCl2溶液，供研究者根据需要添加。

（2）其他成分

4种dNTP混合物　　　　　　　　 各200µmol/L

2种引物　　　　　　　各0.25µmol/L

模板DNA　　　　　　　　　　　　　　 0.1µg

耐热DNA聚合酶　　　　　　　　　　　　2.5U

注意：①引物一般用TE配制成较高浓度的母液（约100µmol/L），保存于－20℃。使用前取出其中一部分用ddH2O配制成10µmol/L或20µmol/L的工作液；②加入的模板DNA浓度与模板种类、纯度、扩增目的等有关；③酶量过多将导致产生非特异性产物。当降低反应体积时（如20µl或50µl），一般酶的用量仍不小于2U，否则反应效率将降低。

（3）PCR反应条件

注意：①热变性时间过短，可能导致变性不充分，但时间过长，易使酶失活；②引物的Tm值影响着PCR退火温度的设置。比Tm值低或高很多的退火温度都不能获得满意的扩增。

（一）引物

PCR反应中引物浓度一般为0.2～1µmol/L。引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：一是容易形成引物二聚体（primer-dimer）；二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。一般说来，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。

（二）反应缓冲体系

PCR反应中缓冲液是一个重要的影响因素，提供PCR反应所必需的合适的酸碱度和某些离子，特别是其中的Mg2+能影响反应的特异性和扩增片段的产率。一般随Taq DNA聚合酶供应。

目前最常用的缓冲液是10～50mmol/L的Tris-HCl（pH 8.3～8.8，20℃），在72℃（通常PCR反应延长阶段的温度）时，其pH为7.2左右，故在实际的PCR反应体系中，其pH于6.8～7.8之间变化。Tris-HCl用于调节反应体系pH，使Taq酶在偏碱性环境中发挥活性。

Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200µmol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异性扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

KCl有利于引物与模板退火，高于50mmol/L 的KCl对Taq DNA聚合酶有抑制作用。

（三）耐热DNA聚合酶

最早用于PCR反应的酶是大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow酶，由于此酶对高温耐受性差，每次变性时绝大部分酶失活，所以每经过数个循环则需要重新添加新酶，致使实验操作复杂化且增加实验成本。以后人们曾使用T4 DNA聚合酶和T7 DNA聚合酶，两者虽使扩增特异性增加和DNA合成速度提高，终因热稳定性差而未得到广泛应用。直到发现Taq DNA聚合酶有很高的耐热性（经95℃持续高温仍有活性），加酶一次可完成整个PCR反应。

Taq DNA聚合酶是从一种水生栖热菌（thermus aquaticus，简称Taq）yT1株分离提取的。yT是一种嗜热真菌，能在70～75℃生长。该菌是1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离的。Taq DNA聚合酶的分子量为94kd，这种酶不显示任何3'→5'核酸外切酶活性，它的最适反应温度在75℃左右，在95℃的高温中具有良好的热稳定性。

在100µl PCR反应体系中，一般加入2～4U的酶量，足以达到每分钟延伸1 000～4 000个核苷酸的掺入速度。酶量过多将导致产生非特异性产物。但是，不同的公司或不同批次的产品常有很大的差异，由于酶的浓度对PCR反应影响极大，所以应当做预试验或使用厂家推荐的浓度。当降低反应体积时（如20µl或50µl），一般酶的用量仍不小于2U，否则反应效率将降低。

1．酶活性与热稳定性 该酶基因全长2 496个碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子为 94kd。其比活性为200 000 U/mg，75～80℃时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷酸，70℃延伸率大于60个核苷酸/秒，55℃时为24个核苷酸/秒。温度过高（90℃以上） 或过低（22℃）都可影响Taq DNA聚合酶的活性，该酶虽然在90℃以上几乎无DNA合成，但确有良好的热稳定性，在PCR循环的高温条件下仍能保持较高的活性。在92.5℃、95℃、97.5℃时，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分别经130min、40min和5～6min后，仍可保持50%的活性。实验表明，PCR反应时变性温度为95℃ 20s，50个循环后，Taq DNA聚合酶仍有65%的活性。Taq DNA聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反应的前提条件，也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的原因。Taq DNA聚合酶还具有反转录活性，其作用于类似反转录酶。此活性温度一般为65～68℃，有Mn2+存在时，其反转录活性更高。

2．离子依赖性 Taq DNA聚合酶是Mg2+依赖性酶，该酶的催化活性对Mg2+浓度非常敏感。以活性程度很低的鲑鱼精子DNA为模板，dNTP的浓度为0.7～0.8mmol/L时，用不同浓度Mg2+进行 PCR反应10min，测定结果为MgCl2浓度在2.0mmol/L时该酶催化活性最高，此浓度能最大限度地激活Taq DNA聚合酶的活性。Mg2+过高就会抑制酶活性，当MgCl2浓度在10mmol/L时可抑制40%～50%的酶活性。由于Mg2+能与dNTP结合而影响PCR反应液中游离的Mg2+浓度，所以MgCl2的浓度在不同的反应体系中应适当调整，优化浓度。一般反应中Mg2+浓度至少应比dNTP总浓度高0.5～1.0mmol/L。适当浓度的KCl能使Taq DNA聚合酶的催化活性提高50%～60%，其最适浓度为50mmol/L，高于75mmol/L时明显抑制该酶的活性。

3．忠实性 Taq DNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性和5'→3'外切酶活性，而无3'→5'外切活性，它不具有Klenow酶的3'→5'校对活性。因而，在PCR反应中如发生某些碱基的错配，该酶是没有校正功能的。Taq DNA聚合酶的碱基错配概率为2.1×10－4。

4．抑制剂 低浓度的尿素、甲酰胺、二甲基甲酰胺（DMF）和二甲基亚砜（DMSO）对Taq DNA聚合酶的催化活性并无影响。极低浓度的离子表面活性剂，如脱氧胆胺酸钠（小于0.06%）、十二烷基肌氨酸钠（小于0.02%）、十二烷基磺酸钠（SDS，小于0.01%），几乎可完全抑制该酶的活性。而非离子表面活性剂在较高浓度（如>5%）时方能抑制该酶的活性。

（四）脱氧核苷三磷酸（dNTP）的质量与浓度

dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1mol/L NaOH或1 mol/L Tris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.0～7.5，小量分装，－20℃冷冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200µmol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其他几种（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过高可加快反应速度，同时增加碱基的错误掺入率和实验成本。浓度过低会导致反应速度的下降，但可提高实验的精确性。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。

（五）模板（靶基因）

PCR对模板的要求不高，单、双链DNA均可作为PCR的样品。虽然PCR可以用极微量的样品（甚至是来自单一细胞的DNA）作为模板，但为了保证反应的特异性，一般还宜用微克水平的基因组DNA或104拷贝的待扩增片段作为起始材料。原材料可以是粗制品，某些材料甚至仅需用溶剂一步提取之后即可用于扩增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白，将可能干扰PCR反应。

传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，从而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白；SDS还能与蛋白质结合而沉淀。蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提除掉蛋白质和其他细胞组分，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

三、PCR循环参数设置

PCR反应条件包括温度、时间和循环次数。

温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸3个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短的靶基因（长度为100～300bp）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸（此温度时Taq DNA酶仍有较高的催化活性）。

（一）变性温度和时间

变性温度低，解链不完全是导致PCR反应失败的最主要原因。一般情况下，93～94℃ l min足以使模板DNA变性。变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。在变性中，温度太高或反应时间过长，会导致酶活性的损失。Taq DNA聚合酶活性的半寿期：92.5℃为2h以上，95℃为40min，97℃为5min。

（二）复性温度和时间

退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。可通过以下公式帮助选择合适的引物的复性温度：

Tm值（解链温度）=4（G+C）＋2（A+T）

复性温度=Tm值－（5～10℃）

在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60s，足以使引物与模板之间完全结合。

（三）延伸温度和时间

Taq DNA聚合酶的生物学活性如下。

● 70～80℃ 150核苷酸/s/酶分子

● 70℃ 60核苷酸/s/酶分子

● 55℃ 24核苷酸/s/酶分子

● 高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。

PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间可根据待扩增片段的长度而定，一般1kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10kb需延伸至15min。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

（四）循环数

循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在25～30次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。需要进一步增加产量时，可将第一次PCR产物稀释后再扩增，而不要盲目增加循环数，以免增加非特异扩增。

（五）PCR仪的使用

以美国PE GeneAmp PCR System 2 400或9 700扩增仪为例。

模板温控式PCR仪是大多数研究者使用的机型，通过对金属模块温度的调控，进而控制插于金属模块中PCR管的温度。

1. 打开主机电源，进入主菜单（ Main Menu）。

2. 按箭头键“←↑→↓”选择文件（File） 菜单，对原有程序进行编辑或新建新程序。

3. 新建扩增程序：在文件菜单 Standard 中选择标准程序，分步设置温度和反应时间等参数。

4. 按 Enter 键，输入程序名称，保存程序。

5. 返回主菜单，调出所设计的扩增程序，按 Start，运行程序。

6. 运行程序结束后，取出扩增管，冷却热盖装置，关闭电源。

四、PCR结果的检测分析

PCR扩增反应完成之后，必须通过严格的鉴定，才能确定是否真正得到了准确、可靠的预期特定扩增产物。

（一）凝胶电泳

凝胶电泳是检测PCR产物常用和最简便的方法，能判断产物的大小，有助于产物的鉴定。凝胶电泳常用的有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，前者主要用于DNA片段大于100bp者，后者主要用于检测小片段DNA。

1．琼脂糖凝胶电泳 这是实验室最常用的方法，简便易行，只需少量DNA即可进行实验。其原理是不同大小的DNA分子通过琼脂糖凝胶时，由于泳动速度不同而被分离，经溴化乙锭（EB）染色，在紫外光照射下DNA分子发出荧光来判定其分子的大小。

用于电泳检测PCR产物的琼脂糖浓度通常为1%～2%，应该使用纯度高的电泳纯级琼脂糖，这种琼脂糖已除去了荧光抑制剂及核酸酶等杂质。

2．聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖凝胶电泳繁琐，但在引物纯化、PCR扩增指纹图、多重PCR扩增、PCR扩增产物的酶切限制性长度多态性分析时常用到。

它与琼脂糖凝胶电泳比较具有如下优点：①分辨率很强，可达1bp；②能装载的DNA量大，达每孔10µgDNA；③回收的DNA纯度高；④其银染法的灵敏度较琼脂糖中EB染色法高2～5倍；⑤避免了EB迅速褪色的弱点，银染的凝胶干燥后可长期保存。

3．酶切分析 根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。

（二）分子杂交

分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法。

1. Southern印迹杂交 在两个引物之间另合成一条寡核苷酸链（内部寡核苷酸）标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状。

2. 斑点杂交 将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。

（三）核酸序列分析（测序）

是检测PCR产物特异性的最可靠方法。PCR产物电泳后，为了保证产物是真正的目的片段而非假阳性，必须割胶回收后进行测序。PCR技术与自动测序技术相结合，成为一种最快、最有效的测定核苷酸序列的方法。

（四）PCR产物克隆

当PCR产物过少影响测序结果，或者需要大量的PCR产物用于后续实验时，需要对实验得到的PCR产物进行扩增（即克隆）。其通用的方法是把PCR扩增后的产物连接到相应的载体后，再转移到相应的细菌菌株中扩增。