胶体金标记免疫电镜技术已广泛应用于生物医学,主要优点如下。①胶体金以直接吸附方式与蛋白结合,不破坏蛋白质生物活性,对细胞微细结构破坏较小;②金颗粒电子密度高,电镜下图像反差大,且颗粒呈圆形,均匀,易于辨认和精确定位;③易于制备,且可根据需要,制备大小不同的胶体金颗粒(1~150nm),因此可用于双重或多重标记;④金颗粒具有强烈激发电子能力,不仅可用于透射电镜的超薄切片观察,也可用于扫描电镜细胞表面抗原标记的定位观察。本节主要介绍胶体金标记免疫电镜技术。
(一)包埋前胶体金标记免疫电镜技术
包埋前免疫标记是在标本未做固定或轻微固定后进行免疫标记,标记后再用2%戊二醛+2%多聚甲醛固定以保存超微结构,特别适用于标记对固定剂敏感的抗原。以前的包埋前标记物因细胞膜穿透能力差,一般只适用于标记细胞表面抗原。20世纪90年代,国外成功制备了1nm的金标记探针,这种探针能穿透组织和细胞膜,可成功应用于细胞内抗原标记。
1.细胞表面抗原标记(间接法)
(1)样本用PBS漂洗2次,再用0.5%戊二醛+2%多聚甲醛室温固定0.5~1h。可根据抗原对固定剂的敏感度选择适当的固定液和固定时间(如4%多聚甲醛固定1~4h)。
(2)PBS漂洗3~5次,每次20min。
(3)用0.1mol/L甘氨酸漂洗样本5min,灭活自由醛基。
(4)用含1%BSA(牛血清白蛋白)的无钙、镁Dulbecco′s PBS漂洗样本15min,阻断与一抗的非特异性结合。
(5)加适当稀释的第一抗体,样本室温下孵育1~2h。
(6)用无钙、镁Dulbecco′s PBS漂洗样本5次,每次5min,除去未结合一抗。如果非特异性染色背景很高,可在漂洗液中加0.1mol/L的EDTA。
(7)加适当稀释的胶体金探针(可以选择二抗-胶体金、蛋白A-胶体金或蛋白G-胶体金)室温孵育样本30min。
(8)用无钙、镁Dulbecco′s PBS漂洗样本5次,每次5min。
(9)室温下用2%戊二醛+2%多聚甲醛(用0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液配制, p H7.4)再次固定样本1h,用0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液漂洗,1%锇酸后固定。
(10)常规脱水、包埋,超薄切片,醋酸铀-柠檬酸铅染色,透射电镜下观察(或可按常规扫描样品制备方法处理,扫描电镜下观察)。
(11)对照组可省略一抗或用正常血清、正常IgG等无关抗体代替一抗。
2.细胞表面抗原标记(直接法)
(1)前4步操作同间接法。
(2)加适当稀释的第一抗体-胶体金复合物室温孵育细胞lh。
(3)按间接法步骤(8)~(11)操作。
(二)包埋后胶体金标记免疫电镜技术
包埋后胶体金标记较包埋前标记应用的更广,样本经固定、包埋、切片后在超薄切片上进行免疫标记。分为间接法和直接法。间接法敏感性比直接法高,故仅介绍前者。
1.标本经PBS洗2次,0.5%戊二醛+2%多聚甲醛室温固定0.5~1h。
2.PBS漂洗5次,每次20min。
3.用0.1mol/L甘氨酸漂洗标本5min,灭活自由醛基。
4.用PBS漂洗标本3次,每次10min。
5.用1%锇酸后固定1h。
6.常规脱水、包埋。
7.超薄切片厚50~70nm,将切片捞在200~300网孔的镍网上。
8.置1%H 2 O 2内10~60min(时间视树脂的硬度和切片的厚度而定),去除锇酸的同时增加树脂通透性,以利于抗体进入(在切片很薄或低温包埋时,此步可省略)。操作时,滴1滴1%H 2 O2液于蜡板上,然后将带有切片的镍网轻轻漂浮在液滴上(切片面向下)。对中枢神经系统切片,可用1%过碘酸钾(KIO4)代替H 2 O2。
9.去离子双蒸水漂洗切片3次,每次10min。第1、2次洗法如步骤8,第3次以盛双蒸水的注射器沿镍网面平行冲洗,水流应有适当压力,但不宜过强,用滤纸沿镍网边缘吸干残余水滴。
10.切片用1%BSA或5%正常血清(无钙、镁Dulbecco′s PBS或TBS配制)孵育15~ 30min,阻断对第一抗体的非特异性结合。可用5%BSA孵育1h去除非特异性标记,但BSA的浓度过高或孵育时间过长可能会使标记率下降。
11.加适当稀释的第一抗体室温孵育1~2h。一抗用含0.1%BSA的无钙、镁Dulbecco′s PBS或TBS稀释。
12.PBS或TBS漂洗切片3次。
13.入PBS(含1%BSA,p H8.2),室温反应5min(为胶体金结合准备)。
14.加适当稀释的胶体金探针(可以选择二抗-胶体金、SPA-胶体金或蛋白G-胶体金)室温孵育30~60min。
15.PBS或TBS漂洗切片5次。
16.去离子双蒸水冲洗切片。
17.醋酸铀和硝酸铅双重染色,透射电镜下观察(对照组可省略一抗或用正常血清、正常IgG等无关抗体代替一抗)。
(赵 艳)
思考题
1.简述电子显微镜和光学显微镜的异同点。
2.生物超薄切片是如何制备的?
3.简述包埋后胶体金标记免疫电镜技术的操作程序。
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