脂肪细胞和肌肉细胞

2010年10月，在美国和全世界范围内进行的脂肪组织衍生干细胞临床试验就有32项，这些都是由国家和私营机构支持的并且登记在册的。近3年来这些研究的数量迅速增加。除了现有临床试验的靶标疾病外，脂肪组织衍生干细胞的临床治疗潜力更加广泛，可以治疗的疾病谱也更宽。在这些疾病中，肌肉萎缩疾病正受到人们的密切关注。我们将在这里评估源自脂肪组织的干细胞治疗肌肉疾病的潜能。

（一）肌萎缩和间充质干细胞

骨骼肌即使在遭受严重的外伤时也具有强大的再生能力。大多数再生肌纤维起源于卫星细胞，即肌前体细胞，它们位于肌纤维中、基底层下，平时处于静止状态，一旦遭受外伤即能进行自我修复。在损伤区域产生的不同信号作用下，它们增殖分化成肌母细胞，或者与现存的纤维汇合，或者互相融合成新的多核纤维。同时这些卫星细胞再重新进入壁龛，使后者保持源头丰富。在肌萎缩中替换坏死的纤维时也出现了类似的过程，Duchenne肌萎缩或者杜兴肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）就是这样一个例子。这是一种严重而多发的疾病，源于先天性或者遗传性肌营养不良蛋白基因的突变/缺乏，导致肌营养不良蛋白缺乏所致。这一致死性的肌肉退行性疾病是一种最常见的遗传性肌萎缩疾病，平均3500个男孩中就有1例发病。肌营养不良蛋白是一种肌膜下蛋白质，通过大蛋白复合物来连接肌膜和细胞外间质。在很多次坏死再生周期之后，卫星细胞的修复能力被消耗殆尽。肌纤维萎缩并被纤维组织和脂肪组织所替代。随后功能丧失导致严重的病理状态。虽然杜兴肌营养不良在20年前就已有报道，但到目前人们还没有发现阻止其变性的治疗措施。大家正在努力寻找包括以药物、基因和细胞为基础的各种治疗措施。应用同源或者异源细胞的主要目的是诱导受损肌细胞的再生修复或者重新组成。这样，寻找一种能够有效再生肌肉的细胞群落在评估新的细胞治疗疗效上就显得意义非凡。包括肌母细胞、中胚层成血管细胞、肌肉或者血液中CD133+细胞在内的几种细胞类型都成为人们关注的重点。间充质干细胞因其具有分化潜能以及强大的自我更新能力也成为很有潜力的候选细胞。

在1995年以前，间充质干细胞被认为是一种多潜能前体细胞，但尚未有其成肌特性的报道。其后，Arnold Caplan实验室报道了大鼠的骨髓源间充质干细胞经脱甲氧-5氮杂胞苷复合物处理后可以分化成多核肌管，表明这些细胞可能成为肌前体细胞。他们猜想在特定条件下间充质干细胞能够被诱导成为成肌表型。这种情况也可能在再生肌肉中找到。他们把鼠骨髓源间充质干细胞注射到mdx鼠肌肉内。mdx鼠是一种杜兴肌营养不良动物模型，因为它们的肌肉主要由经历退化和再生周期的肌营养不良蛋白阴性肌纤维构成，但这种鼠并不出现严重的病理状态。它们是研究肌肉再生的最好模型。移植之后，肌营养不良蛋白阳性肌细胞数量明显增加，表明间充质干细胞能够分化成肌细胞。这些研究结果扩大了间充质干细胞的分化潜能，同时也提出了重要的新问题，包括这些细胞成肌能力的生理学相关性问题。对于间充质干细胞肌肉修复能力的研究为人们开辟了一个崭新的领域。

（二）脂肪源干细胞具有形成在体肌的潜力

正如在其他研究领域的发展一样，继应用骨髓来源间充质干细胞的开拓性工作之后，来自于脂肪组织的间充质干细胞也被认为有肌肉分化能力。在21世纪的早期，就有人已经开始研究脂肪源干细胞的成肌潜力。

曾经有研究报道将脂肪源干细胞移植到动物的肌肉内。Bacou和同事们率先研究了脂肪血管基质碎片细胞，即未分化脂肪细胞群的潜能。研究者将收集到的自体细胞采用LacZ标记后移植到损伤的兔肌肉内，发现它们可以发展到再生肌肉纤维的10%。细胞移植2个月之后，肌肉变得发达而且肌力增加。该研究小组因此证实脂肪组织基质血管碎片具有肌形成潜能。同样地，将未经培养的鼠脂肪组织衍生干细胞注射到mdx鼠的肌肉中或者因股动脉切除损伤的非瘫痪的小鼠肌肉中，通过去除大腿动脉产生非动力性肌萎缩，发现受体肌肉各增加了10%和20%。但是将体外扩充的脂肪组织衍生干细胞注射进受体鼠体内后只发现少量的鼠肌纤维来源于注射的供体细胞。最后还发现，由人的脂肪组织衍生干细胞形成的肌纤维已经长入再生鼠肌纤维中。脂肪组织衍生干细胞有助于受伤的免疫缺陷鼠和mdx鼠的肌纤维再生（图12-2）。通过人特异性抗体标记鼠的肌纤维切片，检测到脂肪组织衍生干细胞细胞源性肌纤维。从注射了脂肪组织衍生干细胞的鼠肌纤维中，通过提取RNA进行RT-PCR检测时发现了更多的人特异性肌纤维标志物。将吸脂术得到的脂肪组织衍生干细胞移植到鼠下肢肌萎缩2B模型也可以获得类似的结果。因此，移植到肌肉再生条件下的脂肪组织衍生干细胞显示出可分化成骨骼肌纤维的巨大潜能。

图12-2　hMADS细胞在肌肉再生中的作用。野生小鼠、mdx和经hMADS注射的mdx小鼠的胫骨前肌冷冻横断切片染色显示肌营养不良蛋白的表达。大约500000个hMADS细胞被注射入mdx小鼠的肌肉内，前者针对肌营养不良蛋白的遗传缺失进行连续的降解和再生循环。hMADS移植2周后，可见肌营养不良蛋白部分的恢复

（三）脂肪源干细胞的体外成肌潜力

为了进一步研究脂肪源性干细胞的体外成肌潜力，人们在细胞培养皿上进行了大量的研究。

（四）自身成肌潜力

当前，几个团队都在研究脂肪组织衍生干细胞自体成肌分化的机制，研究者之间的共识是在没有任何肌肉样环境的条件下，培养的脂肪组织衍生干细胞成肌分化能力非常有限。只有在当细胞接近融合时撤除血清和添加胰岛素等适宜培养条件下，肌母细胞的完全分化能力才会出现。然后肌母细胞停止增殖并表达成肌决定因子（myogenic determination factors，MyoD，Myf5）及其他成肌调控因子（myogenic regulatory factors，myogenin，MRF4）。它们融合成细长的多核肌管，表达众多的肌肉终末标志物。肌管是可以在细胞培养中所能得到的最终端分化物，只有在存在神经支配的活体，肌管才能完全形成肌纤维。在研究脂肪组织衍生干细胞在成肌分化的所有报道中，都可发现这些干细胞应用肌形成培养基培养时，在早期能表达早期甚至一些晚期肌肉标志物，但难以分化成为肌管。这些结论已经从吸脂获得的脂肪组织衍生干细胞和切取的脂肪组织实验中得到验证。即使我们使用最佳的培养基，脂肪组织衍生干细胞中肌小管的出现率仍然很低，不到0.1%，并且只在少数供体细胞中才有出现。类似的结果也出现在从鼠的皮下脂肪组织和脂肪垫获得的脂肪组织衍生干细胞中。因此，脂肪组织衍生干细胞的肌分化能力低于脂肪分化潜能和软骨分化潜能。这就出现了一个问题：决定活体肌肉再生能力的是所有脂肪组织衍生干细胞细胞群共有的低肌肉分化水平潜能呢，还是只限于少量细胞亚群所具有的成肌潜能呢？

（五）脂肪组织衍生干细胞和成肌细胞共培养时的成肌潜能

脂肪组织衍生干细胞具有极弱的自发性成肌潜能，但是它们在活体促进肌纤维再生的能力，说明肌肉环境对成肌分化的重要性。为了研究这一问题，人们将脂肪组织衍生干细胞在体外与成肌细胞或者使用成肌细胞或者肌小管的条件培养基共同培养。将人或者鼠的脂肪组织衍生干细胞使用GFP标记后和C2C12鼠成肌细胞株或者原代培养的鼠成肌细胞混合，在成肌分化培养条件下共同培养。两种方法培养都可以检测到GFP阳性肌小管，而且人的GFP阳性肌小管表达巢蛋白，后者在肌细胞中强烈表达。这表明脂肪组织衍生干细胞能够融合于肌细胞而合成肌小管。另外，Di Rocco及其同行发现分化中的成肌细胞含有促进脂肪组织衍生干细胞分化的可溶性因子。该实验表明，共同培养时脂肪组织衍生干细胞和肌细胞一样能够融合成肌小管，并能够表达肌蛋白。然而，这些肌蛋白的产量很低，最多时只有1%的脂肪组织衍生干细胞能够产生肌小管。而且，很难证实和肌细胞共同培养能明显增加脂肪组织衍生干细胞的细胞单独成肌分化潜能。但是在低水平百分比时也需要考虑到测量的精确程度，所以不能完全排除少量脂肪组织衍生干细胞可能在不易察觉的情况下与肌细胞进行融合的情况。和肌细胞紧密接触的一些非成肌细胞，也可能参与分化中肌细胞大量融合的进程。

（六）脂肪组织衍生干细胞的基因修饰

以上数据表明，在达到可以进行临床应用的标准之前，人们还需对脂肪组织衍生干细胞的肌肉修复潜能有所改进。为达到这一目的，可以考虑如下两种方案。假设并不是所有基质血管碎片细胞均具有成肌潜能，则可以通过例如细胞克隆，从脂肪基质血管碎片细胞中获取更多的具有成肌潜能的细胞亚群。这个假设目前为止还没有得到证实。另外，如果候选的细胞比率很少，特别是在这些细胞不能进行体外扩增时，就会存在一定的困难。解决方案是获取大量的脂肪组织，但这却只能在某些特定条件下才能达到。另一个替代方案是对脂肪组织衍生干细胞进行基因修饰，使它们具有更高的成肌潜能。我们使用脂肪组织衍生干细胞，假定细胞对一种关键的成肌基因（例如成肌决定因子）的过度表达，可能明显增强它们的内源性成肌潜能。表达成肌决定因子基因的脂肪组织衍生干细胞可以通过在磷酸肌酸激酶（phosphoglycerate kinase，PGK）启动子的控制下，编码鼠的成肌决定因子基因，然后携带成肌决定因子基因的慢病毒载体转染细胞而获得。这些细胞经过复杂的基因修饰后成为成肌决定因子-脂肪组织衍生干细胞。

（七）成肌决定因子-脂肪组织衍生干细胞的体外成肌分化潜能

成肌决定因子-脂肪组织衍生干细胞在肌形成条件培养基中形成多核肌管，与真正的肌母细胞一样，表达早期和晚期分化成肌标志物。而野生的或者磷酸肌酸激酶-LacZ病毒载体转导的LacZ-脂肪组织衍生干细胞并不表达此标志物，后者可作为阴性对照（图12-3）。

图12-3　hMADS细胞的体外成肌分化，表现为对MyoD的表达。与野生型的hMADS细胞不同，在成肌培养条件下，MyoD-hMADS细胞可以与肌管完美融合。肌肉蛋白肌间线蛋白、巢蛋白、肌浆球蛋白和肌营养不良蛋白染色后标记为红色，细胞核经Hoechst 34580复染以检测多细胞核肌管，呈现蓝色。标尺=20μm

在共同培养试验中，大量脂肪组织衍生干细胞和杜兴肌营养不良肌母细胞融合构成杜兴肌营养不良-脂肪组织衍生干细胞杂合肌管，可以持续表达肌萎缩蛋白，后者是一种杜兴肌营养不良缺陷蛋白。与肌母细胞的融合能力是肌细胞的基本特性，因此成肌决定因子-脂肪组织衍生干细胞需要这种能力。肌萎缩蛋白的出现表明成肌决定因子-脂肪组织衍生干细胞基因组在融合肌管中表达，因此杜兴肌营养不良肌母细胞和改良的脂肪组织衍生干细胞的细胞融合并不干扰成肌分化过程。这是未来临床应用的先决条件，因为肌肉修复时需要和宿主肌母细胞进行融合。多潜能细胞的一个重大风险就是它们可能分化成为不受欢迎的细胞系。而且，很多肌萎缩患者在肌肉间隙有纤维脂肪组织浸润，这些脂肪细胞分泌大量的细胞因子形成一个成脂环境，因此研究肌决定因子-脂肪组织衍生干细胞的成脂分化潜能就很有必要。只要在细胞融合具备成脂分化的条件时，野生型或者LacZ-脂肪组织衍生干细胞就很容易进行成脂分化。脂肪组织衍生干细胞的高度成脂分化潜能明显地受到肌决定因子强制性表达的抑制。总结以上结果表明肌决定因子-脂肪组织衍生干细胞具有显著的体外成肌潜能，对于这一潜能的进一步研究可以用于肌萎缩的修复。

（八）成肌决定因子-脂肪组织衍生干细胞的体内肌肉修复能力

人们将肌决定因子-脂肪组织衍生干细胞移植到Rag2－/－gC－/－免疫缺陷鼠的再生肌肉内，用以评估脂肪组织衍生干细胞中肌决定因子的表达在肌肉修复中的重要性。对照组为来自野生型或者LacZ-脂肪组织衍生干细胞。肌肉再生由在动物后肢的胫骨前肌制造冷伤常规诱导产生。4周后应用人特异性lamin A/C抗体可以检测到脂肪组织源性细胞核。这些阳性的细胞核不仅出现在肌纤维之内，也可见成簇状或者变成卫星细胞散在地存在于肌纤维之间，表明了脂肪组织衍生干细胞在鼠肌纤维的不同部位都有存活（图12-4）。相对野生型或者LacZ-脂肪组织衍生干细胞而言，成肌决定因子-脂肪组织衍生干细胞源细胞核更多地出现在肌纤维内。肌肉断层切片表明，人和鼠的细胞核总是出现在同一肌纤维内。这表明肌决定因子-脂肪组织衍生干细胞和鼠的再生纤维融合，这和体外的研究结果一致。

应用人特异性肌肉标志物研究成肌决定因子-脂肪组织衍生干细胞源性肌纤维时发现，人血影蛋白一般表达在肌纤维的肌膜上，在lamin A/C细胞核阳性染色的再生区域肌纤维细胞膜上都可检测到（图12-5）。脂肪组织衍生干细胞源性肌纤维的存在也可以通过其他肌肉标志物或者通过RT-PCR特异性扩增验证得以证实（图12-6）。上述这些标志物包括肌纤维膜上的δ肌膜蛋白聚糖和肌纤维细胞膜上的肌萎缩蛋白。人血影蛋白标记程度可作为测定成肌决定因子修饰的脂肪组织衍生干细胞所产生活体效应的定量检测指标。与野生型或者LacZ-脂肪组织衍生干细胞相比，成肌决定因子-脂肪组织衍生干细胞对人血影蛋白阳性纤维的表达数量要高5倍（图12-7）。更重要的是，在整个实验过程没有发现肿瘤或者其他副作用的发生。

图12-4　小鼠肌肉中由hMADS衍生的细胞核。500000个hMADS细胞被注射入Rag2-/-免疫缺陷小鼠的胫骨前肌肌肉内。注射同时对肌肉行冷伤处理以刺激肌肉再生。1个月后，提取肌肉制作横断切片进行人特异性抗lamin A/C（红色）和抗laminin（绿色）染色。细胞核由DAPI（蓝色）复染。在所有的肌肉中都发现了由hMADS衍生的细胞核

总之，脂肪组织衍生干细胞中成肌决定因子的被动表达增强了所移植细胞促进肌肉再生的能力，从而有益于肌肉损伤的修复。另外，它们还阻止了脂肪组织衍生干细胞的内在成脂潜能。评判该技术手段的有效性还需要和目前治疗动物肌萎缩模型的最有效细胞进行比较，即血管源性成血管母细胞和外周血中的AC133＋细胞。