组织工程皮肤的动物实验方法

一、实验前准备

（一）动物的购入

购入动物或领取动物时，应向供应部门索取所用动物的遗传背景和微生物质量资料（包括动物质量合格证），以及动物品系、年龄、体重、胎次等资料。若是清洁级以上的实验动物，应采取无菌运输装置。长途运输时，还应考虑运输环境产生的影响。除此之外，还应核实动物笼盒数量、饲养室卫生、消毒情况及动物饲料、垫料的准备情况。

（二）动物的标记

动物标记的目的在于个体识别。常用方法有，染色法、烙印法、针刺法、挂牌法、穿耳孔法、断趾编号、剪尾编号、被毛剪号、笼子编号。给大鼠、小鼠、豚鼠背部染色标号，最常用的是80%～90%苦味酸乙醇饱和溶液或3．5%～5%的苦味酸溶液，涂成黄色（可识别2～3个月），其次是0．5%中性红或碱性品红溶液，其他染色剂如甲基蓝持续时间较短。给兔、狗等动物标记的染色液最常用的是2%硝酸银溶液，其次为苦味酸溶液。染色法简单易行，但不宜用于长期实验，可以根据实验安排结合其他标记方法应用。

（三）麻醉

实验动物的麻醉工作应该在兽医师指导下进行。麻醉中应细心观察，严密监视直至手术结束动物苏醒并使用镇痛剂后，人员才可离开动物。有关麻醉时可能需要使用的仪器设备（包括急救药品和器械）应准备齐全。大动物在术前8～12h应禁食，以免麻醉或手术中发生呕吐。家兔或啮齿类动物术前无须禁食。手术动物在麻醉前可以给予一定量饮水。

1．麻醉前给药 ①阿托品，肌内或皮下注射0．04mg／kg体重；②地西泮，腹腔或肌内注射2．5～5mg／kg体重；③吗啡（一般不使用），皮下注射1～2mg／kg体重或肌内注射10～20mg／kg体重。

2．实验动物常用全身麻醉剂及其剂量、途径见表34－1。

表34－1　各种动物常用的全身麻醉剂的剂量及途径

二、组织工程皮肤动物实验中各类动物模型的复制

（一）体表烧（烫）伤动物模型

外界55℃以上温度的热力作用于动物体表一定时间后，即可复制出实验性烧（烫）伤模型。局部组织损伤程度取决于致伤温度、作用时间、组织结构特征及机体反应性。有的学者认为还应该考虑致伤压力产生的影响。烧伤或烫伤深度判定以伤后稳定24h的烧（烫）伤深度为标准，与临床上使用的“三度四分法”基本一致（表34－2）。

表34－2　动物烧烫伤创面特点

烧伤面积的大小是决定烧伤严重程度的重要因素之一。计算动物体表面积的方法常用公式计算法和计算板法。前者的计算方式为S＝0．1×W2／3，式中S为体表面积（m2），W为体重（kg）。后者是根据动物身长、体重和体表面积间的一定比例关系绘制而成，适用于大批量的动物实验。因大面积严重烧伤引发的全身反应较重，易造成动物死亡，所以目前在组织工程皮肤动物实验中通常采用小于10%烧伤创面。主要有下列方法。

1．点状温热烫伤 Sevitt于1949年创立点状温热烫伤法，被认为是标准的烫伤模型制作方法。点状烫伤器为一中空紫铜圆柱，高11．6cm，底端直径1．5cm，自重0．5kg。进水管接恒温水浴锅，恒温水（60± 1）℃进入圆柱后，由侧管流出，不循环流转，圆柱外包裹石棉防止散热。该方法可控性好、重复性高，适用于大、小动物。近来又有恒温电烙器、恒温恒压电烫仪等装置用于复制模型，也可采用热铜板、铜盘等简易工具（表34－3）。

表34－3　不同动物热压法烧伤模型复制

2．直接热水烫伤　将动物的某个部位（通常是背部）浸入热水中一段时间，一般用于小动物致伤，有时也用于大动物。不同的动物、部位、水温和时间可造成不同程度的烫伤。此方法致伤深度易于控制，重复性好，但烫伤面积控制不精确（表34－4）。

3．热蒸汽烫伤　用湿布保护烫伤区周围正常皮肤，用高温水蒸气（100～120℃）喷射目标区一定时间即可致伤。

4．火焰烧灼法　将凝固汽油、煤油、无水乙醇等燃料直接涂布于烧伤区皮肤，周围用湿布加以保护，点燃烧灼一定时间后以湿布扑灭（表34－5）。该方法简单易行，适用于大小动物，但可控性略差，造成的创面深度可能会不均一。

表34－4　不同动物热水浸烫法烧伤模型复制

表34－5　不同动物火焰烧灼法烧伤模型复制

a．25ml汽油、60ml 95%乙醇、5ml丙三醇、5ml二甲苯、5ml植物油、60g松香混匀；b．100ml汽油、100ml 95%乙醇、100ml二甲苯、100g松香、6g生胶，浸泡2d，搅拌均匀

5．闪光粉烧伤法　将动物固定于特制的烧伤台上，台底留有与所需面积相同大小的烧伤孔，孔周包以耐火材料。烧伤孔下方置一火药槽，槽内放适量闪光粉，以点火花引火造成烧伤。

6．电光源烧伤法 以5kW溴钨灯做强光辐射源，利用灯的焦点热源致伤。先将烧伤区及其周围正常皮肤分别用石棉板屏障，预热溴钨灯20s，立即去除烧伤区石棉板致伤。通过调节光源距离和光照时间，制造不同程度烧伤，该方法操作方便、经济、卫生，控制性、重复性好（表34－6）。

表34－6　5kW溴钨灯烧伤模型的复制

（二）皮肤切除模型

该模型是利用特制打孔器（或利刃）将动物皮肤进行全层切除。该方法是组织工程皮肤动物实验中最常用方法，对动物种类、部位、创伤面积没有限制。创伤部位通常选择动物背部脊柱两侧各旁开2cm处。有的实验涉及断层皮创面，可以利用取皮刀或取皮鼓切取一定厚度的皮肤，既可取至真皮浅层，也可取至真皮深层，以保留部分真皮及皮肤附属器。

（三）化学烧伤

强酸强碱是化学烧伤常用药物，通常采用6mol／L HCl或2．5mol／L NaOH浸透圆形纱布，紧贴于实验区20～75s，除去纱布后立即用脱脂棉擦干皮肤表面残留的HCl或NaOH，5min后大量清水冲洗创面即可（表34－7，表34－8）。

表34－7　6mol／L HCl对兔皮肤不同作用时间的烧伤结果

表34－8　2．5mol／L NaOH对兔皮肤不同作用时间的烧伤结果

（四）电烧伤

电烧伤大多以高压电烧伤为严重，适用于中等或大动物。以兔为例，去除双后肢部分兔毛安置电板，连接高压电放电装置，以10 000V电压电击5s后即解除电极板，所造成的损伤可在此后5～7d内逐渐表现出来。

（五）感染创面模型

为研究组织工程皮肤抗感染能力及其在修复迁延不愈的慢性感染创面中的作用，可以在细菌培养皿中进行体外抑菌实验，也可以通过感染创面动物模型来观察。感染创面可分为侵入性感染和非侵入性感染，人体创面的“临界菌量”为105个／g组织，动物创面的“临界菌量”可能更高一些。实验者可以根据需要，在皮肤缺损创面上涂抹相应种类和数量的细菌（真菌），造成感染创面。

（六）药物性皮肤坏死模型

复制药物性皮肤坏死模型常用药物有阿霉素（25g／L）、纯蜘蛛毒等，于实验动物皮下注射。阿霉素常用量为大鼠50～500μg／部位×14d，兔7～15μg／部位×14d。蜘蛛毒的用量为10～15μg／部位，几小时后即出现皮肤苍白，并逐渐出现出血、坏死等现象。

（七）放射性溃疡模型

用放射线局部照射杀死局部组织修复细胞而造成体表皮肤坏死，放射源通常为60 Co γ辐射源，也可以用X射线或中子源。

（八）糖尿病溃疡模型

复制糖尿病动物模型的方法主要有：①注射致高血糖因子，如生长激素、胰高血糖素、糖皮质激素及儿茶酚胺等；②注射化学物质引起胰岛B细胞损伤，如链佐星、四氧嘧啶、二苯硫代卡巴腙可造成胰岛B细胞不可逆损伤，环丙庚哌、天门冬素酶等可引起B细胞可逆性损伤；③注射生物及生物制品可引起B细胞破坏，如鼠脑炎、心肌炎病毒M型变异、白介素－1等；④手术切除胰腺；⑤筛选引种繁殖遗传性及自发性糖尿病，因动物难以形成自发性溃疡，故须人为致伤动物皮肤形成创面。该模型须定期复查随机血糖，应保证始终≥16．7mmol／L。

（九）汗腺、毛囊缺失模型

为了验证组织工程皮肤重建汗腺、毛囊的能力，有时需要选用一些皮肤附属器不发达的动物模型，如裸鼠、狗等。

（十）生物安全性研究模型

生物安全性是组织工程产品首要考虑的问题，检测标准应参照国际标准化组织、美国材料实验协会、英国标准协会及我国国家技术监督局对生物制品、医疗器械的有关方法和规定实施。检测对象包括制备人工皮肤的各个主要组分、人工皮肤高低温渗出液、培养基及陈旧培养基。选择的实验动物包括狗、猫、家兔、豚鼠、大鼠、小鼠等中小动物。主要包括以下项目（以家兔为例）。

1．热原反应实验　将连测5d肛温正常的家兔随机组；分别将待测样品以2ml／kg进行腹腔注射；注射1h后测兔肛温，以后早晚各测1次，连续7d。

2．皮内注射实验　制备人工皮肤的花生油、生理盐水浸出物，高温消毒备用；术前2d兔背脱毛备皮；在兔脊柱两侧各选5个实验区，每区选5个点，自身左右对照，分别注射花生油和生理盐水浸出物，每点0．2ml；注射后15min、1h、1d、2d、3d，观察皮肤反应（红斑、水肿等）。

3．皮肤致敏实验　术前2d家兔右背脱毛备皮，将人工皮肤在家兔右背保留5min，阴性对照和阳性对照组分别涂敷DMEM和0．05%2，4－二硝基氯苯；第7天、第14天重复右背刺激；第26天左背脱毛备皮，再于第28天在左背分别接触相应处理因素；连续观察3d左背有无充血、红肿、硬结等发生。

4．全身过敏实验　实验组家兔腹腔隔日注射0．5ml人工皮肤浸出液，阳性对照组则腹腔注射0．05%2，4－二硝基氯苯0．5ml；在第14天、第21天再分别注射上述溶液，观察有无异常反应发生，如抓鼻、竖毛、惊厥反应。

5．眼结膜角膜刺激实验　自身左右对照，每一家兔左、右双眼分别滴100μl人工皮肤陈旧培养基、DMEM培养基；滴加溶液后连续观察7d，观察兔眼有无充血水肿、局部组织破损等发生。

6．降压物质检查实验 将家兔麻醉后固定，分离颈动脉、静脉，其中静脉置入给药通道，动脉连接生理记录仪；静脉推注0．05、0．1、0．15g／kg标准组胺，观察血压改变，确证动物符合试验要求后由股静脉快速推注5ml／kg浸出液，重复3次，期间静注组胺0．1μg／kg，作为阳性对照。

（十一）免疫反应模型

为研究移植物在宿主体内产生的免疫反应，可以选择以动物细胞为种子细胞制作人工皮肤，而后移植到同种异体动物体表进行观察。研究人工皮肤在人体内的免疫排斥反应则需要特殊的动物模型，在SCID小鼠研究中发展出来的嵌合体小鼠较好地解决了这个问题。该模型是用人胎肝、骨髓、胸腺等组织块或外周血单核细胞移植给SCID小鼠，形成小鼠－人的血－淋巴系嵌合体SCID－hu小鼠或SCID－hu－PBL小鼠。人工皮移植到嵌合体小鼠体表可以产生类似人体的免疫反应。

三、手术操作

实验动物创面表面移植组织工程皮肤的过程和要求与临床植皮手术基本相同。其要点在于组织工程皮肤应与创面紧密相贴，不留死腔和空隙。包扎方法可采用多层纱布加压包扎或打包包扎。根据创面大小、部位及人工皮韧性综合考虑进行选择。根据需要，也可以在皮下放置小室或海绵，以了解创面愈合的连续性病理变化。在创周固定适当的标记物也利于愈后寻找所植入的人工皮。手术后待动物完全清醒并使用镇痛药物后送回动物房，并给予适当的抗生素和止血药物。

四、术后管理

动物在术后常见的问题是疼痛、呼吸减弱、反胃呕吐和饮水不足。疼痛时，可给足够的镇痛药；呼吸减弱可于术后给予吸氧，反胃呕吐可能是术前未禁食，术后应侧卧，保持呼吸道通畅、饮水不足可通过补液予以补充。低体温休克是动物实验后死亡的一个重要原因，所以应将室温控制在25～30℃。

术后应连续3d检测实验动物肛温、呼吸频率及饮食情况，并观察受皮区渗血、渗液情况。术后7～14d可酌情解除压力包扎，启视移植皮片。若皮片红润表明人工皮存活并已建立毛细血管网，若皮片颜色灰暗或分泌物较多，则可能是表皮坏死。

五、实验动物的处死

实验结束后，实验动物应采取安乐死法进行处死。常用无痛苦死亡的处死方法有颈椎脱臼法、过量麻醉法，此外还有断头法、毒气法、放血法、空气栓塞法等，实验人员可根据实验情况选择。

（王亚洲　伍津津）

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