冷冻保护剂

冷冻保护剂（cryoprotectant）即抗冻剂，是指可以保护组织细胞免受冷冻损伤的物质。冷冻损伤是组织细胞冻存最主要的副反应，冷冻保护剂的应用是减少冷冻损伤的一种重要方法，是冷冻保存组织细胞不可缺少的部分。

一、冷冻保护剂的分类

冷冻保护剂有多种分类方法，如低分子量和高分子量冷冻保护剂，传统的分类法是根据其对细胞膜的渗透率大小来分的。一般可分为2类，即渗透性与非渗透性冷冻保护剂。

（一）渗透性冷冻保护剂

主要为小分子物质，多易溶于水，与水分子结合的能力强，易穿透细胞膜进入细胞内部，在细胞内能降低细胞的冰点；并提高细胞膜对水的通透性，减少冰晶形成，复苏时促进细胞外水分进入细胞，缓解渗透性肿胀引起的损伤；稀释未结冰溶液中电解质的浓度，减少溶质损伤。渗透率快的通常在30min内完成，包括甲醇（methanol）、乙醇（ethanol）、乙二醇（ethylene glycol，EG）、丙二醇（propylene glycol，PG）、二甲基酰胺（dimethylformamide）、甲基乙酰氨基苯（methylacetamide）、二甲亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）、丙三醇（glycerol）渗透较慢。常用的渗透性冷冻保护剂为二甲亚砜（浓度以10%保存效果较佳）和丙三醇（以10%～15%浓度较佳）。有研究表明，透入性抗冻剂中乙二醇（ethylene glycol）毒性最低，其次是二甲亚砜（DMSO）。

（二）非渗透性冷冻保护剂

一般是大分子聚合物，不能渗透到细胞内部，通过稀释胞外电解质的浓度，减少溶质损伤和结合水分子，降低胞外自由水的含量，减少冰晶损伤，当浓度在10%～40%时起到细胞外冷冻保护作用，包括单糖（monosac－charide）、多糖（polysaccharide）、甘露醇（mannitol）、山梨醇（sorbitol）、葡聚糖（dextran）、羟乙基淀粉（hydroxyethyl starch，HES）、甲基纤维素（methyl cellulose）、白蛋白（albumin）、明胶（gelatin）、聚维酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）、聚氧化乙烯（polyethylene oxide，PEO）、聚乙烯醇（polyvinyl alcohol）等。

此外，尚有一种新型冷冻保护剂——抗冻蛋白。抗冻蛋白（antifreeze Proteins，AFP）最初发现于南极附近海域的鱼类，这些蛋白使得极地鱼能够在低于其体液冰点的温度下生存。现已证明，一些陆生节肢动物、维管植物、非维管植物、真菌和细菌等也存在该蛋白。一般认为，AFP是生物体对寒冷环境长期适应的结果，对寒带动植物的抗冻能力有着十分关键的作用。

抗冻蛋白（AFP）都是一些较小的蛋白质（或多肽），在生物体内AFP往往是与糖基结合以抗冻糖蛋白（antifreeze glycoprotein，AFGP）形式存在；糖基主要由三肽糖单位［－Ala－Ala－Thr（双糖基）－］串联重复而成，是抗冻活性形成的主要基团，对糖基进行化学修饰（乙酰化和过氧化）后会导致抗冻活性的丧失。另外，抗冻糖蛋白的活性与分子量有关，分子量大者一般活性也高。总的来说，抗冻蛋白可分为鱼类抗冻蛋白、昆虫抗冻蛋白和植物抗冻蛋白三大类。鱼类抗冻蛋白的研究开展较早，比较深入和系统，目前一般使用的都主要以鱼类抗冻蛋白为主。迄今为止共发现了4种鱼类抗冻蛋白，它们分别是Ⅰ型（AFPⅠ）、Ⅱ型（AFPⅡ）、Ⅲ型（AFPⅢ）和Ⅳ型抗冻蛋白。此外，在一些真菌、细菌和苔藓中，以及蜘蛛、蜈蚣甚至蛇的毒液中，也发现有抗冻蛋白的存在，它们的结构尚未有文献报道。总的来说，不同的AFP有相似的性质，但在热滞活性方面有所差别，三类中以植物抗冻蛋白最低（0．2～0．5℃），鱼类抗冻蛋白次之（0．7～1．5℃），昆虫抗冻蛋白最高（3～6℃）。

二、冷冻保护剂的低温保护机制

不同渗透率的冷冻保护剂通过不同的机制发挥保护效应。冷冻保护剂可在细胞内和细胞外起保护作用。所有渗透性冷冻保护剂都是高亲水性的，因为它们存在与水分子结合形成强有力氢键的化学基团，尤其是羟基、酰胺、亚砜、羧基和氨基基团，因此，许多冷冻保护剂也能保护生物组织和细胞及其蛋白质免受干燥、热破坏及辐射损伤。通过对具有低温保护特性的二甲亚砜与低亲水性无低温保护特性的二甲砜比较，发现高亲水性在低温保护中的重要性。同样，2，3－丁二醇的D型和L型异构体具有高亲水性，它们对红细胞具有低温保护作用，而其内消旋型为低亲水性，对红细胞的低温保护作用明显降低。渗透性冷冻保护剂使细胞膜具有更大的可塑性，依数性地束缚细胞内水分，防止细胞过度脱水，降低盐毒性和防止细胞内大冰晶形成；促进形成细微的冰晶结构而在低于低共熔点时形成凝胶样的玻璃化状态，从而阻止细胞高渗性损伤和盐所致细胞表面损伤。一些冷冻保护剂增加了膜通透性而在低降温速率时可能有益。依照依数性理论，渗透性冷冻保护剂通过降低一种单一的依数性基础，即结冰的水量，而降低电解质浓度。另一方面，非渗透性冷冻保护剂黏附在细胞表面形成一个黏稠层，使细胞内部分水分外渗，提高溶液的黏滞度，抑制冰晶生长，使无定形冰结构非常近似于细胞，然而它们不直接影响细胞膜结构。

丙三醇、二甲亚砜和许多其他冷冻保护剂依数性地降低水和生物性液体的冰点（丙三醇／水最低达－46℃，二甲亚砜／水最低达－73℃），因此它们降低溶液中的电解质浓度，从而抑制渗透性休克；它们也防止低共熔结晶。除依数性效应外，二甲亚砜的低温保护作用也与它保护细胞表面免受高渗压力损伤的能力有关。二甲砜与二甲亚砜相反，它缺乏低温保护能力可能是由于冻结过程中它在溶液中的沉淀作用，使其浓度在零下温度时无增加。

冷冻保护剂／氯化钠／水系统相位图表明，羟基化合物，如糖（海藻糖、蔗糖等）或丙三醇的保护效能可能是由于这些冷冻保护剂能束缚盐（NaCl）而处于一种高黏或玻璃化状态，从而防止有害的细胞液低共熔结晶。如在低于0℃时形成的一种高黏的海藻糖－水“糖浆”（“玻璃化”）能阻止氯化钠／水的低共熔转换，水分子似乎被束缚于海藻糖分子之间（0．35g水／g海藻糖保持不冻结），抑制冰晶形成。这种情况也可以在蔗糖的水溶液中见到，与海藻糖的低温保护功能相似。

冷冻保护剂低温保护功能的其他机制也偶尔提及。认为在冻结过程中聚氧化乙烯分子与生物学上几种重要的金属离子发生反应。天然冷冻保护剂海藻糖和L－脯氨酸在冻结过程中可稳定细胞膜并恢复变化的膜结构。丙三醇和二甲亚砜可保护草分枝杆菌囊泡免受冷冻损伤；这些小囊泡含有电子传递链的酶。研究表明，二甲亚砜、丙三醇、蔗糖、羟乙基淀粉、聚维酮和葡聚糖具有表面活性。与丙三醇相比，二甲亚砜能影响细胞膜且能刺激核苷酸聚合酶引起细胞内系统转录。

冷冻保护剂效能量化有一个推荐的公式，即Q＝V×S，Q代表冷冻保护剂保护系数，V代表冷冻保护剂的挥发度，S代表冷冻保护剂的摩尔溶解度。Q值越大，冷冻保护剂的低温保护效能越强。根据这个理论，渗透性冷冻保护剂在水中的挥发度和溶解度是它的2个非常重要的特性。显然，冷冻保护剂的氢离子供体和受体基团在其对生物组织和细胞冻融损伤的保护潜能上起重要作用。然而，目前要准确地推测一种冷冻保护剂的实际效能是非常困难的，甚至是不可能的，因为冷冻损伤和防护的确切机制尚不清楚。因此，对不同生物组织和细胞其最好的冷冻保护剂及最佳浓度必须根据反复实验的经验而定。二甲亚砜（10%）逐渐被认为是最常用的冷冻保护剂，尽管其他冷冻保护剂对某些生物组织和细胞有时可能起更好的保护作用。

各种抗冻蛋白结构各异，其抗冻机制也不尽相同，一般来说有以下几种机制：①以非依数性形式降低水溶液的冰点而对其熔点影响甚微，导致水溶液的熔点和冰点之间出现差值（即热滞效应，其降低冰点的效率是依数性盐类的200～500倍），在低温冻存中能非连续地降低溶液冰点。②通过吸附－抑制机制，即吸附于冰晶的特殊表面，通过降低细胞内非胶着物质溶液的冻凝温度来改变冰晶生长，使水溶液中冰晶在棱面的优势生长受到抑制，限制其只能在基面上生长，从而改变冰晶的结构、大小和数目，有效阻止冰晶生长（即冰晶形态效应）。③在玻璃化法冷冻保存中可以抑制去玻璃化，提高细胞的存活率（如在30%2，3－丙二醇组成的玻璃化溶液中，加入1%人工合成的抗冻蛋白，可以抑制解冻时去玻璃化的发生）。④具有抑制重结晶发生的作用，防止小的冰晶凝结成更大的冰晶，使形成的晶粒体积小且均匀（即重结晶抑制效应），减轻细胞的冰晶损伤。⑤同时通过与细胞膜作用，稳定膜电位，封闭离子通道，阻止溶质渗漏和离子流失，保护膜完整性（此效应与所用抗冻蛋白的种类和细胞膜的脂类组成有关），有效地减轻溶质损伤。综上所述，适当地将抗冻蛋白应用于生物样品的低温冻存时，能显著提高细胞的存活率，甚至使原先不能存活的样品冻存成功。在实际使用时浓度不宜太高，浓度过高时，虽然能阻止溶液重冰晶，但膜表面会生成大量冰晶。

三、冷冻保护剂的毒性及处理

虽然冷冻保护剂对生物组织和细胞具有低温保护作用，但也有一定的毒性，其毒性反应机制可能是：①通过细胞膜引起的渗透性损伤（物理性损伤）；②与蛋白质和（或）脂膜结合，使之变性（化学性损伤）。这些损伤与温度、冷冻保护剂的含量有关。一般是温度越低，冷冻保护剂毒性越小；冷冻保护剂含量越高，其毒性越大。

由于单一冷冻保护剂作用有限，且含量低时没有保护作用，高含量时又具有毒性。因此，为了降低冷冻保护剂的毒性，提高其保护功效，目前混合冷冻保护剂的研究较多，其目的主要是寻找对相应细胞与组织具有最佳保护效果而毒性最小的不同种类不同含量冷冻保护剂组合。冻存后冷冻保护剂必须进行洗涤，从组织、细胞悬液中清除，降低冷冻保护剂的毒性影响。

另外，由于组织结构的复杂性及细胞的敏感性不同，如何使冷冻保护剂做到对组织与细胞的均匀渗透是冻存保护它们活力的另一重要因素，这就涉及组织与细胞在冷冻保护剂中渗透的预处理，预处理时间的长短根据冷冻保护剂种类、含量、温度、降温速度及组织厚度等来决定。有学者用150g／L二甲亚砜在4℃预处理不同时间后冷冻保存皮肤，结果发现预处理时间10～30min后冷冻皮肤活力较为适宜（90%左右），细胞形态也较好。Wingenfeld等利用47．5g／L、71．3g／L、142．6g／L的二甲亚砜在4℃时依次处理同种骨关节移植物5min、15min、25min后冻存，发现能促进骨血管生成和降低免疫原性。