许多研究发现，体外三维培养环境比二维的培养环境更有利于细胞功能的保持和发挥。单层细胞培养技术所取到的研究结果往往由于受到体外环境改变的影响，逐渐丧失了原有的性状而与在体情况不符。三维细胞培养技术（three－dimensional cell culture）既能最大限度地维持细胞的在体性状，又可分化产生新的组织结构，更利于研究从细胞到组织器官的发育过程。三维细胞培养技术是沟通单层细胞培养和动物实验的桥梁，是发育生物学和再生医学的重要研究手段。三维细胞培养作为体外无细胞系统及单层细胞系统与组织器官及整体之间研究的桥梁，显示了它既能保留体内细胞微环境的物质及结构基础，又能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势。细胞的环境、形状、周围结构及力学特征对基因表达及细胞行为学发挥着十分重要的影响。
三维细胞培养技术将细胞培养在充当生长支架的特定细胞外基质中，可以最大限度地模拟在体细胞生长环境条件，使细胞能够分化产生一定的三维组织特异性结构。根据培养方式的不同可分为静止三维细胞培养和动态三维细胞培养。近20年来，三维细胞培养技术在组织形成，血管发育和器官重建等发育生物学的交叉领域，如组织工程领域及药物疗效分析和毒理实验方面得到了广泛应用，其中静止三维细胞培养多应用在组织构建的早期，在组织工程皮肤构建中应用较广泛，但存在因重力作用，使接种细胞沉积于支架材料下部的缺陷。如果构建的组织较大，还存在中心部分细胞营养不良的问题。动力性三维细胞培养由于能够均匀接种细胞，能够促进氧气和营养物质向支架内部输送，为细胞代谢和功能发挥提供更有利的微环境，保持支架内部细胞活性和功能的发挥，分泌更多细胞外基质等优点，主要用于骨、软骨等组织工程研究中，可通过模拟微重力旋转生物反应器系统、固体转动生物反应器系统、搅动混合旋转培养瓶系统、环绕混合培养皿系统来达到目的。在构建皮肤中也有报道，如Dermagraft，在接种细胞后，通过旋转培养系统来达到均匀接种细胞的目的。
本书主要讲述与组织工程领域相关的三维细胞培养技术，主要包括组织型培养和器官型培养。三维培养可模拟和重建在体组织器官的某些组织学特征。组织型培养指细胞在多孔材料、胶原蛋白凝胶等三维基质中重新聚集、生长，并重建三维组织样结构。器官型培养指将不同的细胞谱系按照实验确定的比率和空间关系结合起来，重新构建研究状态下的器官成分，如在Fb重建的真皮替代物上接种KC后的联合培养。器官型培养的目的是保存不同类型细胞原有的结构关系及由此产生的相互作用，以便研究外源性刺激对进一步发育的影响。这种关系可通过将分离纯化的各细胞谱系重新结合成三维培养物来实现。
一、支架材料的三维培养
支架材料的三维培养在皮肤组织工程中主要指成纤维细胞接种在多孔材料里的组织型培养，是含活细胞真皮替代物的常用构建培养方法。对水凝胶类材料，通过搅拌即可将细胞比较均匀地分散在其中；而对海绵类或泡沫类多孔支架，直接接种细胞悬液难于将细胞分散均匀，因为在重力作用下，细胞会沉积于材料的下部。通过旋转装置等机械手段或先将细胞混入水凝胶类材料，之后再加入材料的孔隙中均可达到均匀接种细胞的目的。
二、组织工程皮肤的气液界面培养
器官型培养的主要缺陷是缺乏血管系统，组织的大小将影响气体的扩散、营养物质和代谢产物的交换。器官型培养的组织必须放在理想的气体和营养物质交换位置，常常采用气液界面培养、动态培养解决上述问题，其支撑常选用不锈钢筛网、微孔滤膜等。对组织工程皮肤产品来说，气液界面培养的目的是促进表皮的层化、分化。只有经过气液界面培养，双层组织工程皮肤才具有分化良好的角质层。研究表明，浸没培养的胶原凝胶类双层活皮肤替代物的表皮细胞分化不够理想，移植时易碎、抗感染力差，如果采用气液界面培养法3周后表皮细胞已长成类似正常皮肤的结构，有半桥粒和基膜形成，可增加移植强度，延长存活期，并能尽早具有皮肤屏障功能，在创面覆盖愈合后平滑、光亮，整容效果好。
三、共培养技术
细胞共培养技术是研究细胞间相互关系的重要手段。通过细胞共培养可以观察2种以上不同类型细胞之间的相互作用，主要方法有：①混合共培养。将所研究的不同种类细胞混合在同一培养器皿中培养，观察细胞的直接接触，但很难将培养在一起的不同种类细胞分离观察，如使用滋养细胞的KC培养法。本法可以研究细胞的直接接触效应，被广泛用于KC和黑素细胞的相互作用研究。②微载体珠共培养。一种细胞培养在培养板孔中，另一种细胞培养在微载体上，随后加入到培养板孔中，一定时间内观察2种细胞的相互作用。这种方法培养时间宜短（一般应小于4h），以防止细胞从微载体上迁移至培养皿中。也可把2种细胞一起培养在微载体上模仿微重力状态进行培养。③微孔滤膜插入装置（插入式培养皿）共培养法。一种细胞接种在生物相容的微孔滤膜插入装置里，另一种细胞培养在培养板孔中，将前者放入板孔中即可实现共培养。不同细胞分泌的可溶性因子通过微孔滤膜相互作用。④三维胶原凝胶共培养法。在Ⅰ型胶原制成的凝胶中进行2种细胞的共培养，此法方便进行组织学检查，是研究皮肤细胞相互作用的良好模型。但存在2种细胞不能分开的缺陷。
在组织工程研究中，共培养技术还被用来评估生物合成材料与细胞的相容性或天然细胞外基质对细胞生物学行为的影响。如特定细胞与特定生物合成材料共培养，研究材料对细胞的毒性、黏附性等；骨髓间充质干细胞与骨组织共培养时，前者表现成骨特性。
（朱堂友 伍津津）
参 考 文 献
［1］邓跃毅，陈以平，张志刚．贴壁细胞共培养的一种方法．中华病理学杂志，1999，28（4）：298
［2］R．I．弗雷谢尼．动物细胞培养－基本技术指南．章静波，徐存拴，等，译．第4版．北京：科学出版社，2004：480－493
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