毛囊组织工程的方法

构建能模拟胚胎环境并支持胚胎样毛囊发育的组织工程皮肤是研究毛囊诱导的重要手段，但基于该模型的文献报道甚少。可以产生皮肤附属器的实用型组织工程皮肤的研究还在进行中。

一、真皮替代物诱导毛囊形成

1994年，Limat等首先在皮肤成纤维细胞或DPC胶原凝胶上接种DPC与ORSC的混合细胞Matrigel凝胶，构建了双层真皮替代物体外毛囊诱导模型，FAD培养基浸没培养3d后气液界面培养20d，在该模型中诱导出平均直径为（0．36±0．08）mm的囊肿样结构，免疫组化证明其向表皮分化。1998年，Havlickova等在Ⅰ型鼠尾胶原中接种人头皮成纤维细胞，充分收缩后再接种混入Matrigel中的DPC。24h后，或者接种ORSC悬液，或者接种Matrigel与DPC、ORSC混合细胞凝胶，采用添加维生素C的FAD培养基浸没培养，14d后诱导出平均直径为（0．522±0．12）mm的同心圆排列细胞团，证实是向毛囊分化。两者所用的各种细胞浓度均为1×106个／ml，ORSC为单细胞法培养的2～4代细胞。

设计人毛囊器官型体外系统，必须尽可能地模拟活体情况，并且应该满足以下条件：①真皮支持系统提供毛囊上皮与毛囊间质通过天然的细胞外基质直接相互作用的三维环境；②毛囊上皮与毛囊间质通过基底膜型细胞外基质相互作用；③形态学上，三维系统允许毛囊上皮细胞形成理想的同心细胞聚合以模拟活体毛囊内外根鞘或毛母质那样功能上紧密相连的上皮组织部分；④该系统的上皮细胞应显示毛囊／ORSC型增生、角化（如表达CK6、CK14）；⑤大多数完整毛囊上皮活体情况都是在完全“浸没”条件下，因此，诱导三维系统不应在气液界面培养而应持续浸没培养。

毛囊是一复杂的亚器官系统，虽然体外诱导产生了一些结果，但准确地说还是毛囊样结构，不是真正的毛囊，而且多是在有特殊肿瘤细胞分泌的细胞外基质Matrigel中诱导成功的。Matrigel是从EHS（Engelbreth－Holm－ Swarm）小鼠肉瘤中抽提得到的可溶性基底膜提取物，富含层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、Entactin、硫酸肝素糖蛋白等细胞外基质蛋白和TGF－β、FGF、组织纤溶酶原激活物、金属蛋白酶和其他的一些生长因子。这些物质对毛囊细胞的黏附和分化有效应作用。体外模型目前未能诱导出完整毛囊的可能原因在于组织工程皮肤系统并不能完全模拟毛囊发育的胚胎环境和提供完整的毛囊发育的信号环境。

二、双层组织皮肤替代物诱导毛囊形成

国内刘晓亮用大鼠外根鞘细胞和真皮鞘细胞胶原凝胶构建的皮肤替代物中，未见皮肤附属器形成。耿松海等用人头皮K19阳性ORSC细胞与头皮Fb胶原凝胶的双层皮肤替代物未见皮肤附属器产生。伍津津等在毛乳头细胞、真皮鞘细胞胶原凝胶真皮替代物上接种毛囊上皮细胞，体外在真皮替代物中诱导出中心角化、数层呈同心圆排列的上皮细胞团的毛囊样结构，裸鼠移植后诱导出了结构紧密的毛囊结构，并有穿出表皮的完整毛干纤维形成。

Watson等用完整的羊触须毛乳头和胎鼠表皮片与羊Fb胶原凝胶构成人工皮肤，移植重建后，镜下可见角化毛发的毛囊结构，而与分散KC的组合共培养未能诱导成功。由于胎鼠表皮片中有各种发育阶段的毛囊，该研究又未对诱导毛囊的来源进行研究，未能引起广泛关注。Gharzi等用鼠下段真皮鞘细胞、完整的毛乳头和外根鞘细胞构建人工皮肤，移植后产生了肉眼可见的毛发。到目前为止，该研究是毛囊细胞来源皮肤替代物唯一成功诱导出完整毛囊的报道。从上皮干细胞的多向分化出发，中山大学的研究小组用人羊膜诱导小鼠胚胎干细胞，使其转化为表皮干细胞，再接种到小鼠Fb胶原－吸收性明胶海绵真皮替代物上，皮下埋植后诱导出囊肿样毛囊结构和一些腺样结构。但未结合毛囊真皮细胞的诱导能力进行研究。Miyashita等先用大鼠足垫KC与滋养细胞胶原凝胶重建皮肤，再从皮肤替代物的真皮面将2～4个混入Matrigel的新鲜毛乳头紧贴重建表皮的基底细胞，之后移植到大鼠和裸鼠皮下，诱导出各种阶段的毛囊、毛发和皮脂腺。

三、诱导毛囊形成中毛囊真皮细胞和各种上皮细胞的影响

（一）毛囊上皮细胞的影响

不同的研究模型发现的各种上皮细胞在毛囊形成中的被诱导能力有差异。Reynolds等发现大鼠毛母质生发上皮细胞分别与真皮鞘细胞和高代DPC组合，耳廓创口移植后均诱导产生了触须型毛囊和毛发，而与毛囊外根鞘细胞、皮肤基底细胞的组合没有成功诱导。说明毛母质生发上皮细胞具有胚胎细胞样特性，并可显著改变毛乳头细胞、真皮鞘细胞的行为。但Inamatsu等的研究发现大鼠无毛区KC可以延长大鼠DPC的传代次数，并维持其凝集性生长特性和诱导毛囊形成能力，说明毛囊外的上皮细胞也能改变毛囊真皮细胞的特性。众多的研究发现，毛乳头细胞能诱导无毛区皮肤产生毛囊，说明这些非毛囊上皮细胞也具有被诱导能力。培养的ORSC的被诱导能力被Gharzi等的研究证实。

（二）诱导毛囊形成研究中毛囊真皮成分细胞的影响

不同来源的真皮细胞存在形态、行为和生物合成上的差异。目前，所有研究的共识是毛囊间成纤维细胞和皮肤Fb没有诱导毛囊形成的能力。尽管DPC和DSC具有相同的胚胎来源，体外培养时均有较高的生物合成特性，在体时在结构和功能上可相互替代，但两者在解剖方面、一些生化反应方面及诱导能力上存在差异，如毛乳头细胞高表达碱性磷酸酶，而在真皮鞘细胞，只有球周真皮鞘细胞表达，而且有人认为只有球周真皮鞘细胞才具有诱导能力。一些作者认为，只有DPC具有形成毛乳头样结构的内在生物钟特性，单独移植到皮肤后能形成不连续的毛乳头样结构且易于辨认，而DSC就不具备这样的生物钟。但实际的实验研究却发现，对人类来说，可能真皮鞘细胞的诱导能力更重要。将男性头皮源毛囊的球部真皮鞘移植到女性前臂，诱导产生了完整毛囊和大而黑的毛发，而移植毛乳头却诱导失败。其原因可能是移植后毛乳头从伤口脱落或被免疫排斥掉。在去掉人毛囊毛球部后，真皮鞘细胞可诱导上段毛囊再生新的完整毛囊和毛发。这表明真皮鞘细胞在人毛囊重建中有着重要的诱导作用。

（三）细胞外基质的影响

毛囊的体外诱导多以失败告终。其原因在于，这些研究仅仅模拟了毛囊上皮和间质的接触作用环境，忽略了细胞因子、细胞外基质的协调参与在毛囊发育中的重要作用。研究发现，细胞外基质可以显著改变上皮细胞的分化方向。Ferraris等用兔中心角膜（排除干细胞影响）与小鼠胚胎背部及足掌真皮构成重组体，诱导出正常小鼠表皮和毛囊皮脂腺单位，说明在胚胎真皮间质的影响下，不同的短暂增殖细胞群可重新获得一些干细胞特性，间质微环境不仅可改变上皮干细胞的命运，还可改变分化细胞的命运。Fliniaux等用小鼠羊膜上皮与小鼠胚胎真皮组成复合体，诱导形成了完全的毛囊、皮脂腺和表皮，进一步证实了间质能够影响上皮分化。

四、双层组织工程皮肤诱导毛囊形成研究的展望

尽管毛囊上皮细胞和真皮细胞生物学特性优于皮肤的KC和Fb，在构建组织工程皮肤替代物中也能替代皮肤的细胞成分，修复效果也令人满意，但与通过它们在组织工程皮肤替代物中产生毛囊等皮肤附属器的初衷相比，还有很远的差距。虽然双层组织工程皮肤是研究上皮和间质相互作用的良好模型，但毛囊的发育是一个复杂的过程，还需要动态的信号、激素环境和细胞外基质的协调参与。而仅依靠毛囊来源的种子细胞（如毛乳头细胞、真皮鞘细胞、毛囊上皮细胞）、简单的支架材料（如胶原、Matrigel凝胶）和接种细胞分泌的有限细胞外基质和细胞因子这种模型，在体外培养的条件下还很难诱导毛囊形成，并形成功能，产生毛发，在模拟毛囊发育的环境上存在先天缺陷。同时，分离培养具有多向分化潜能的毛囊干细胞在技术上存在一定的困难，因此，基于此的体外诱导模型无疑会导致失败，必须从种子细胞选择（如毛囊干细胞、毛乳头细胞）、支架材料的三维结构构建，体外培养的营养条件（包括诱导分子信号）等多方面条件入手，尽可能模拟出毛囊发育和再生过程中的环境条件，才有可能重建出毛囊结构，形成带毛囊皮脂腺的组织工程产品，其中还存在许多未知因素，需要不断地探索。随着干细胞研究的进展，结合中山大学的研究报道，用多能干细胞与有诱导能力的毛囊真皮细胞来构建双层皮肤替代物，使我们看到移植后产生皮肤附属器的希望。

（朱堂友　伍津津）

参 考 文 献

［1］Reynolds AJ，Jahoda CAB：Hair matrix germinative epidermal cells confer follicle－inducing capabilities on dermal sheath and high passage papilla cells．Development，1996，122：3085

［2］Inamatsu M，Matsuzaki T，Iwanari H，et al．Establishment of rat dermal papilla cell lines that sustain the potency to induce hair follicles from afollicular skin．J Invest Dermatol，1998，111：767

［3］Mcelwee KJ，Kissling S，Wenzel E，et al．Cultured peribulbar dermal sheath cells can induce hair follicle development and contribute to the dermal sheath and dermal papilla．J Invest Dermatol，2003，121（6）：1267

［4］Krugluger W，Rohrbacher W，Laciak K，et al．Reorganization of hair follicles in human skin organ culture induced by cultured human follicle－derived cells．Exp Dermatol，2005，14（8）：580

［5］Robinson M，Reynolds AJ，Gharzi A，et al．In vivo induction of hair growth by dermal cells isolated from hair follicles after extended organ culture．J Invest Dermatol，2001，117：596

［6］Reynolds A，Lawrencet C，Cserhalmi－Friedman PB，et al．Trans－gender induction of hair fillicles－human follicle cells can be induced to grow in an incompatible host of the other sex．Nature，1999，402：33

［7］Tang L，Madani S，Liu H，et al．Regeneration of a new hair follicle from the upper half of a human hair follicle in a nude mouse．J Invest Dermatol，2002，119：983

［8］Jahoda CAB，Oliver RF，Reynolds AJ，et al．Trans－species hair growth induction by human hair follicle dermal papillae．Exp Dermatol，2001，10：229

［9］Randall VA，Sundberg JP，Philpott MP：Animal and in vitro models for study of hair follicles．JID Symposium Proceedings，2003，8：39

［10］Limat A，Breitkreutz D，Hunziker T，et al．Outer root sheath（ORS）cells organize into epidermoid cyst－like spheroids when cultured inside Matrigel：a light－microscopic and immunohistochemical comparison between human ORS cells and interfollicular keratinocytes．Cell Tissue Res，1994，275：169

［11］Havlickova B，Biro T，Mescalchin A，Arenberger P，Paus R．Towards optimization of an organotypic assay system that imitates human hair follicle－like epithelial－mesenchymal interactions．Br J Dermatol，2004，151（4）：753

［12］Kleinman HK，Martin GR：Matrigel：basement membrane matrix with biological activity．Semin Cancer Biol，2005，15（5）：378

［13］Watson，SAJ，Pisansarakit P，Moore GPM．Sheep vibrissa dermal papillae indunce hair follicle formation in heterotypic skin equivalents．Br J Dermatol，1994，131：827

［14］Gharzi A，Reynolds AJ，Jahoda CAB．Plasticity of hair follicle dermal cells in wound healing and induction．Exp Dermatol，2003，12：126

［15］Lin Yi，Li Haibiao，Huang Jintao，et al．Following the fate of murine epidermal stem cells in a syngeneic dermal equivalent in vivo．Burns，2005，31：1007

［16］Miyashita H，Hakamata Y，Kobayashi E，et al．Characterization of hair follocles induced in implanted，cultured rat keratinocyte sheets．Exp Dermatol，2004，13：491

［17］Jahoda CAB．Cell movement in the hair follicle dermis－more than a two－way street？J Invest Dermatol，2003，121（6）：Ⅸ

［18］Panteleyev AA，Jahoda CAB，Christiano AM：Hair follicle predetermination．J Cell Sci，2001，114：3419

［19］Ferraris C，Chevalier G，Favier B，et al．Adult corneal epithelium basal cells possess the capacity to activate epidermal，pilosebaceous and sweat gland genetic programs in response to embryonic dermal stimuli．Development，2000，127：5487

［20］Fliniaux I，Viallet JP，Dhouailly D，et al．Transformation of amnion epithelium into skin and hair follicles．Differentiation，2004，72（9－10）：558

［21］Rogers GE，Hynd PI：Animal models and culture methods in the study of hair growth．Clinic Dermatology，2001，19：105

［22］刘晓亮，金岩，董蕊，等．大鼠毛囊细胞构建组织工程全层皮肤．中国美容医学，2005，14（2）：136

［23］耿松海，曾维惠，谭升顺：利用毛囊干细胞和成纤维细胞重建全层皮肤的研究．中国修复重建外科杂志，2006，20（2）：165

［24］吕中法，伍津津，刘荣卿等．裸鼠重建毛囊的组织学研究．中华皮肤科杂志，2000，33（4）：232

［25］Jin－Jin Wu，Tang－You Zhu，Yuan－Gang Lu，et al．Hair follicle reformation induced by dermal papilla cells from human scalp skin．Arch Dermatol Res，2006，298（4）：183