汗腺细胞生物学

汗腺分为外泌汗腺、顶泌汗腺和大小汗腺（apoeccrine gland）。外泌汗腺即小汗腺，其主要作用为分泌汗液，调节体温，除唇红、龟头等黏膜部位外，皮肤表面几乎都分布有小汗腺，一般掌趾和腋窝分布最多，背部较少。顶泌汗腺即大汗腺，主要分泌具有特殊气味的液体，无体温调节功能，在青春期分泌旺盛，是第二性征的表现之一。

外泌汗腺、顶泌汗腺结构类似。其腺体的细胞都分为腺体和导管部。腺体由腺细胞、肌上皮细胞和基底膜带组成，中央有腺腔。导管由两层小立方形、强嗜碱性的上皮细胞组成。其区别在于顶泌汗腺比外泌汗腺直径大10～20倍，且顶泌汗腺为分支管状腺，外泌汗腺为单曲管状腺。大小汗腺是在分离腋窝多汗症患者腋窝处汗腺时发现的一种独特的腺体，在该类患者中，其腋窝腺体有50%属于大小汗腺，而正常成人腋窝少见这种腺体，它与传统的外泌汗腺和顶泌汗腺有明显区别，其形态变化大，一般其分泌腺管由两段直径不同的管腔组成，粗的一段与顶泌汗腺相似，但其分泌细胞呈柱状，而且含有大量线粒体，细的一段则与外泌汗腺的腺管相同。大小汗腺既受胆碱能神经支配，又受肾上腺能支配，其汗液分泌量为外泌汗腺的10倍，这就与腋窝的多汗症发病有关。

目前对汗腺的研究集中于外泌汗腺的研究。外泌汗腺是皮肤重要的附属器之一，有分泌、排泄和调节体温的作用。体外分离和培养外泌汗腺细胞很有必要，首先，它能提供跨上皮转运机制研究和外泌汗腺相关疾病研究的模型；其次，皮肤组织工程发展至今，已基本解决了创面覆盖问题，但未达到真正组织结构和功能的完全重建，在目前所有的组织工程皮肤产品中，都无皮肤附件，分离和培养外泌汗腺各种细胞能为汗腺的三维重建和带附件的组织工程皮肤的研究奠定基础。

20世纪90年代始，国外有研究者用组织块法进行了外泌汗腺细胞培养和药理学特性方面的研究，由于获得的细胞量少，细胞种类不纯，进一步的持续深入研究受到限制。国内付小兵等研究了表皮干细胞与胚胎期汗腺发生过程的关系，为诱导表皮干细胞向汗腺细胞定向分化奠定基础。雷霞、伍津津等用酶消化法获得了单个的人外泌汗腺腺上皮细胞，操作简便快速，并进行了细胞鉴定，经无血清培养基培养能传代2～5次，为后续研究奠定了基础。其步骤为：在解剖显微镜下挑取皮肤组织中的外泌汗腺，于Ⅳ型胶原酶中37℃中消化，离心后获得汗腺上皮细胞，接种于铺有胶原的培养瓶中培养。研究还发现，用此种方法培养的单层外泌汗腺上皮细胞在乙酰胆碱的刺激下，细胞的钙离子通道开放，细胞内游离钙增加，该分离培养方法对细胞的生理功能影响较小，较适合用于分离培养。

在解剖显微镜（×20倍）下，可清晰地看到淡红色的外泌汗腺分泌部结构，为单曲管状，管状腺体盘旋成不规则球形（图12－1），HE染色可见（图12－2），外泌汗腺分泌部由单层锥体形细胞构成；核位于细胞基部、胞质显嗜酸性，染色较浅；肌上皮细胞位于腺细胞与基底膜之间，细胞扁平，有突起，它的收缩有助于腺细胞排出汗液。免疫组化可见人外泌汗腺腺上皮细胞抗－EMA、抗－CK7染色阳性，阳性部位在胞膜和胞浆，肌上皮细胞抗Actin染色阳性。透射电镜下，可明显区分明细胞和暗细胞，两者大多相间排列，但也可相同细胞相邻，明细胞朝向管腔面的顶部较小，底部大，有少而短的微绒毛，胞质内可见低至中等电子密度的分泌颗粒，胞核在底部；暗细胞则底部小，顶部大，微绒毛多且长，胞核在偏底部，其位置与分泌多少有关，分泌多，胞核被挤向底部，分泌颗粒电子密度高，小的是分泌颗粒，大的可能是溶酶体（图12－3）。

图12－1　汗腺大体结构（×20）

图12－2　外泌汗腺组织学（HE，×200）

体外培养时，外泌汗腺腺上皮细胞为上皮型细胞，接种至铺满胶原的培养瓶中，倒置显微镜下观察，24h后可观察到细胞贴壁，3～4d观察到细胞呈麦粒样生长，3周左右细胞融合呈铺路石样（cobblestone）生长（图12－4），且基本铺满瓶底，融合后的外泌汗腺腺上皮细胞为扁平多角形，中间有圆形核。在培养过程中，我们观察到有转运功能的上皮细胞在培养过程中出现特有的“Dome”形成，即在培养的单层细胞中出现的圆形穹隆样区域，当调节焦距时更显清楚，其成因可能与腺上皮液体跨膜运输有关，从穹隆的尖端运往平底端，也可能与细胞分泌的透明质酸酶有关。培养过程中可能有FB污染，经纯化后几乎无FB生长。

图12－3　外泌汗腺透射电镜（×2 900）

D．暗细胞；L．明细胞

图12－4　培养的汗腺腺上皮细胞（×400）

因为外泌汗腺的最主要功能是分泌汗液，这依赖多种离子通道的共同作用。因此，对外泌汗腺细胞生物学研究最多的是其离子通道和分泌功能。外泌汗腺腺上皮分泌活动受交感神经支配，主要神经递质为乙酰胆碱（ACh）。ACh引起的钙离子通道开放使钙内流是外泌汗腺分泌汗液的基础。在ACh刺激引起的汗腺分泌中，对Ca2＋有绝对的依赖性。汗腺周围神经末梢释放出的或外源性的ACh可与细胞的表面毒蕈碱受体结合，激活钙离子通道开放，细胞钙通道开放，钙内流，细胞内游离钙增高，结果增加了细胞内氯和钾的通透性，构成汗液分泌的基础。钙电离子透入剂A23187可带钙离子经过细胞膜，体外实验证实它是汗液分泌的刺激剂，强度与乙酰胆碱相同。雷霞等在进行了外泌汗腺培养条件的探索后，也对其钙离子通道进行了初步探索。发现了体外单层培养的外泌汗腺腺上皮细胞在乙酰胆碱和ATP的刺激下钙通道开放，发现钙内流，具有分泌汗液的离子活动的基础。

外泌汗腺的活动还与细胞内的ATP代谢有关。ATP在细胞内腺苷酸环化酶的作用下转变成cAMP而发挥作用，内源性和外源性cAMP增多时可使外泌汗腺分泌增多。有研究分别检测了汗腺在异丙肾上腺素（5× 10－6 mol／L）、茶碱（10－3 mol／L）存在时不同时间的cAMP量，结果表明，异丙肾上腺素作用5min，cAMP上升至饱和点，而茶碱作用后cAMP上升甚微，这说明肾上腺素引起汗液分泌与cAMP有关。cAMP的作用机制在于一方面能激活蛋白激酶，促使钙通道活化，增加Ca2＋内流，同时使细胞内结合钙释放形成游离钙，另一方面汗腺分泌部和导管部均有Ca2＋依赖和cAMP依赖的Cl－蛋白通道。

外泌汗腺腺上皮细胞具有主动转运水和离子的功能，这对其分泌汗液起决定性作用。胞质内增高的钙离子增加了细胞内氯和钾的通透性，激活Na＋－K＋－2Cl－转运子，当钠离子被分泌至细胞外，水分也随之排出。短路电流（short circuit current，Isc）是利用电压钳制原理了解细胞离子通道运作情况，Isc的测定可以了解在无电化学梯度的情况下，离子通过电生物膜的主动转运过程，是研究上皮组织离子转运的最佳实验方法，已广泛应用于对肠上皮、鼻黏膜、皮肤等离子转运功能的研究。用Ussing小室检测ACh对汗腺上皮短路电流的影响，以及在不同离子阻断药［如钠通道阻滞药（Amiloride）、氯通道阻断药（DPC和Glibenclamide）、Na＋－K＋－2Cl－转运子阻断药（Bumetanide）］的存在下，对ACh引起的短路电流产生影响，可以进一步了解培养后的汗腺细胞是否仍具有主动转运钠离子、氯离子的功能及相关离子通道的活化情况。已有研究表明，在Millipore滤膜上单层培养的腺上皮细胞在拟胆碱能药物的刺激下，能产生短回路电流，且该电流能被钠通道阻滞药Amiloride阻断，但是未见三维培养下的外泌汗腺腺上皮细胞离子通道研究的相关报道。

（雷　霞　伍津津）

参 考 文 献

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