药物相关基因研究方法

（一）药物相关基因研究

在自然界中，一群同种生物常在某些方面有所不同，存在两种以上变异型的现象，称其为多态性（polymorphism）。在一个群体中由于多个不同的等位基因作用出现两种或两种以上遗传决定的变异型或基因型，一般认为每种变异频率超过1%，称为遗传多态性，不足1%称为罕见变异。

基因序列的多态性构成了等位基因，等位基因的变异体对疾病的影响和对药物效应的影响有着重要的差异，对普通疾病遗传作用十分复杂。人体内许多基因（每个基因都存在一系列变异体）与常见疾病的病理相关，如肿瘤、风湿、糖尿病、心脑血管疾病、精神病等，因而在普通人群中单个基因突变引发疾病的发生率是较低的，如肿瘤，有关的基因突变与疾病发生的相关性不超过5%。因此，任何单一基因及其变异体对疾病的预测或治疗价值都是有限的。相反，单一基因的突变对药物作用的影响则是十分明显的。药物效应相关基因的研究比疾病相关基因的研究更具有临床使用价值。因此，以与药物效应有关的基因为靶点，可研制新药，以基因的多态性与药物效应的多样性为平台可进行药物的临床前药理及临床试验，做到根据基因特征有针对性的选择实验人群，减少实验经费，缩短时间。对原来一些证明“无效”或“毒性反应大”的药物，经过药物相关基因研究有可能证明其对某些人群具有较好的作用，或者说根据基因选择治疗药物可提高药物的有效性，避免不良反应的发生。

药物遗传多态性表现为药物代谢酶的多态性、药物受体的多态性和药物靶标的多态性等。这些多态性的存在可能导致许多药物治疗中药效和不良反应的个体差异。药物相关基因研究就是对决定药物代谢酶、转运体、受体等多态性的基因研究，从基因水平揭示个体差异的遗传特征，鉴别基因序列中的差异，在基因水平研究药效的差异，并以药物效应及安全性为目标，研究各种基因突变与药效及安全性之间的关系。药物相关基因研究以基因组技术为指导，常用方法有基因测序、SNP分析、基因芯片检测、基因频率分析等。

（二）药物相关基因研究方法

基因检测等技术的发展已经给鉴定遗传变异对药物作用的影响提供了前提条件。用高效的测定手段如凝胶电泳技术、包括聚合酶链反应、等位基因特异的扩增技术、荧光染色高通量基因检测技术，来检测一些与药物作用的靶点或与控制药物作用、分布、排泄相关的基因变异。随着人类基因组计划（human genome project，HGP），DNA阵列技术（DNA array technology）、高通量筛选系统及生物信息学的发展，为药物相关基因研究提供了多种手段和思路。

1．药物相关基因研究过程

（1）在确定要研究的某一类或者某一种药物的前提下，通过大量的文献查阅或者基础研究，明确药物在人体内代谢时，需要经过的药物代谢酶、转运体、药物受体或离子通道等信息。

（2）经文献查阅或者研究来证实药物相关基因是否存在多态性，如果存在基因多态性，需要进一步明确基因多态性和药物效应之间的对应关系。

（3）对病人或者正常人进行药物相关基因的多态性的检测，给病人提供合理化的用药方案，明确用药种类以及相应的用药方法，或者为健康人群提供合理化的用药指导，预防不良反应的发生。实现药物相关基因研究的最终目的。

2．药物相关基因检测的方法 药物相关基因检测就是对某一多态性位点进行检测，常用的检测方法如下。

（1）基因测序：基因测序就是将包含多态性位点的片段进行测序，在对片段进行测序前，一般需要用PCR的方法将所需片段进行体外扩增，在试管中给体外合成提供合适的条件：DNA模板，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲液体系以及DNA变性、复性、延伸的温度和时间等。对扩增后的产物进行测序，就能明确所需位点的基因多态性信息。基因多态性最常见的形式是单核苷酸多态性（SNP）。SNP是指同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异或只有小的插入、缺失等。SNP主要从2个方面导致人类个体的多样性。一是编码区SNP（cSNP），cSNP可以改变基因的编码，使得基因表达的蛋白质中某些氨基酸发生变化而影响其功能；二是调节区SNP（rSNP），它往往影响基因的表达和调控，使基因的表达量产生变化。SNP数量多，分布广泛。据估计，人类基因组中每1 000个核苷酸就有1个SNP，人类30亿碱基中共有300万以上的SNPs。SNP适于快速、规模化筛查。组成DNA的碱基虽然有4种，但SNP一般只有两种碱基组成，所以它是一种二态的标记，即二等位基因（biallelic）。由于SNP的二态性，非此即彼，在基因组筛选中SNP往往只需＋／-的分析，而不用分析片段的长度，这就利于发展自动化技术筛选或检测SNP，易于基因分型。对SNP进行基因分型包括三方面的内容：①鉴别基因型所采用的化学反应，常用的技术手段包括DNA分子杂交、引物延伸、等位基因特异的寡核苷酸连接反应、侧翼探针切割反应以及基于这些方法的变通技术；②完成这些化学反应所采用的模式，包括液相反应、固相支持物上进行的反应以及二者皆有的反应。③化学反应结束后，需要应用生物技术系统检测反应结果。

经过测序明确多态性位点的基因多态性信息，在医、药师的指导下，能够为不同病人提供用药方案的信息。

（2）基因芯片检测：近几年发展起来的以高度并行性、高通量、微型化和自动化为特点的基因芯片（gene chip）技术及质谱分析，已作为基因检测的最新技术开始广泛应用于药物相关基因研究。

基因芯片（gene chip）也叫DNA芯片、DNA微阵列（DNA microarray）、寡核苷酸阵列（oligonucleotide array），是指采用原位合成（in situ synthesis）或显微打印手段，将数以万计的DNA探针固化于支持物表面上，产生二维DNA探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号来实现对生物样品快速、并行、高效地检测或医学诊断，由于常用硅芯片作为固相支持物，且在制备过程运用了计算机芯片的制备技术，所以称之为基因芯片技术。

杂交信号的检测是DNA芯片技术中的重要组成部分。以往的研究中已形成许多种探测分子杂交的方法，如荧光显微镜、隐逝波传感器、光散射表面共振、电化传感器、化学发光等，但并非每种方法都适用于DNA芯片。由于DNA芯片本身的结构及性质，需要确定杂交信号在芯片上的位置，尤其是大规模DNA芯片由于其面积小、密度大、点样量很少，所以杂交信号较弱，需要使用光电倍增管或冷却的电荷偶连照相机（charged-coupled device camera，CCD）摄像机等弱光信号探测装置。此外，大多数DNA芯片杂交信号谱型除了分布位点以外还需要确定每一点上的信号强度，以确定是完全杂交还是不完全杂交，因而探测方法的灵敏度及线性响应也是非常重要的。

由于所使用的标记物不同，因而相应的探测方法也各具特色。大多数研究者使用荧光标记物；也有一些研究者使用生物素标记，联合抗生物素结合物检测DNA化学发光。通过检测标记信号来确定DNA芯片杂交谱型。

基因芯片检测的基本过程包括如下步骤。①药物相关基因DNA方阵的构建：该步骤是选择硅片、玻璃片、瓷片或聚丙烯膜、尼龙膜等支持物，并作相应处理，利用基因芯片技术将所需研究的药物相关基因植入基因芯片中，做成针对某一类或某一种药物的基因芯片。如将抗高血压药物的相关基因［CYP2D6＊10、ADRB1（1165G＞C）、CYP2C9＊3、AGTRⅠ（1166A＞C）、ACE（I／D）］植入基因芯片，制成高血压药物相关基因芯片。②样品DNA或mRNA的准备：从血液或活组织中获取DNA／mRNA样品，然后进行PCR扩增，在PCR扩增过程中，必须同时进行样品标记，标记方法有荧光标记法、生物素标记法、核素标记法等。③分子杂交：样品DNA与探针DNA互补杂交要根据探针的类型和长度以及芯片的应用来选择、优化杂交条件。芯片分子杂交的特点是探针固化，样品荧光标记，一次可以对大量生物样品进行检测分析。④杂交图谱的检测和分析：用激光激发芯片上的样品发射荧光，严格配对的杂交分子，其热力学稳定性较高，荧光强；不完全杂交的双键分子热力学稳定性低，荧光信号弱（不足前者的1／35～1／5），不杂交的无荧光。不同位点信号被激光共焦显微镜，或落射荧光显微镜等检测到，由计算机软件处理分析，得到有关基因图谱。目前，如质谱法、化学发光法、光导纤维法等更灵敏、快速，有取代荧光法的趋势。⑤进行基因多态性分析，提供个体化用药方案：通过基因芯片方法能够检测不同个体基因位点多态性信息，综合分析，从而给出合理的个体化用药方案。

（3）RFLP分析：RFLP（restriction fragment length polymorphism），即限制性片段长度多态性，可用于对已知基因多态性位点的分析。不同个体DNA结构上存在差异，在不编码蛋白质的区域及没有重要调节功能的区域，DNA结构个体差异更加明显，这一多态性一般不会引起明显表型改变。这一方法也可用于罕见突变分析。

限制酶（限制性内切核酸酶）最初是从原核生物分离出来的，在DNA分子上有专门的识别序列，即DNA上的一些核苷酸的特定的排列顺序。Ⅱ型限制酶的特点是切割的位置就在识别序列之中，这是在基因工程和基因组分析时常用的一类限制性内切酶。一般统称为限制酶。

限制酶的命名有一定的原则，是按照这种酶是从哪种细菌中分离获得而定名的，限制性内切酶的识别顺序，一般可分为4个核苷酸、6个核苷酸和8个核苷酸。识别4个或6个核苷酸的限制性内切酶是最常用的。限制性内切酶的切割双链的位置就在识别序列之内，切割的方式可分交错切割和双链对称切割两种。

RFLP是指用某种限制性内切酶切割来自不同个体的基因组DNA或某一个基因，会得到不同长度的DNA片段，这表明在这种被切割的不同个体的DNA分子上，这种限制性内切酶的识别序列有差别。例如，当DNA分子中的核苷酸发生改变时，改变的核苷酸正好位于某种限制性内切酶的识别序列内，用这种酶切割DNA时，这个切割位置将因核苷酸改变而消失；于是，切割后生成的DNA片段的数目和长短都会发生改变。同样，如果改变的核苷酸造成了一个原先没有的新的识别位置，则用这种限制酶酶切时，也会是切割后得到的DNA片段的数目和大小发生改变。RFLP在基因分析上有很大的应用价值。利用RFLP方法能够分析药物相关基因位点的多态性信息，能够为临床用药提供指导信息。

（4）单链构象多态性（SSCP）分析：在非变性条件下，单链DNA分子为维持其稳定可自身折叠成一定的空间结构，即构象。这种构象由单链DNA分子中的碱基顺序决定，因此，相同长度的单链DNA分子可因其碱基顺序的不同，甚至单个碱基的不同，而形成不同的构象，这种现象叫做单链构象多态性（single strand comformation polymorphism，SSCP）。在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，单链DNA的迁移率除与DNA链的长度有关外，更主要的是取决于该DNA单链所形成的构象，SSCP分析是用于进行基因突变检测最常见的一种方法，对＜300bp的片段，其检出率可达70%～80%；对＜200bp的片段，其检出率几乎可达100%。其特点为：设备要求简单、无假阳性结果。然而，SSCP检测受到多种因素的影响，如DNA片段的长度、凝胶的浓度和交联度、电泳距离、电泳条件（温度、功率、缓冲液离子强度）、甘油含量等。

（5）PCR-DGGE分析：变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE），通常采用尿素甲酰胺浓度梯度，强度分为根据计算机软件或通过垂直梯度电泳直接测定，100变性强度为7mol尿素、40%（V／V）甲酰胺，聚丙烯酰胺浓度为6．5%（37．5∶1），电泳在恒温水浴（＞30℃）中进行。检测突变所用的DGGE是水平梯度，即变性强度在水平方向是一致的，变性梯度（即尿素甲酰胺的浓度）从阴极向阳极逐渐增强。电泳进程中DNA逐渐由低强度进入高强度，解离温度较低的DNA片段先达到其解离强度（变性梯度）而解离，电泳速度减慢；解离温度高的DNA片段保持原来的电泳速度继续前进，直至到达其解离强度时才发生解离，速度减慢，通过溴化乙啶染色或银染观测区带的变化。

为了使要检测的DNA区充分解离而又保持部分解离的状态，常在引物的5’端增加40bp左右的CG重复片段（即“CG夹”）；有时单个碱基的替换不能引起解离温度的改变，可在PCR后将待测个体的扩增产物与正常个体的扩增产物混合，加热变性然后缓慢复性形成杂交双链，杂交双链在突变部位形成碱基错配，结果杂交双链的变性温度与纯合双链有明显差别，这样即使在突变的纯合双链与正常纯合双链不能区分的情况下，它们的杂交双链也能显示突变的存在。