软骨内成骨的分子调控机制

软骨雏形内的软骨细胞不断成熟、分化以致发育为肥大的软骨细胞，并形成序断性出现的不同细胞外基质成分，同时由软骨细胞形成的基质降解酶（stromelysin）等参与细胞外基质塑型或有序性降解，而使之逐渐呈现可利于软骨钙化乃至骨化发生的形态特征。成骨细胞前体细胞、破骨细胞前体细胞在软骨雏形中出现，即形成骨化中心，骨替代过程开始。

图1-1　长骨软骨内成骨的动态过程

图1-2　长骨软骨内成骨的组织学观察

图1-3　骨干的软骨内成骨模式图

1. Runx-2对软骨细胞分化的调控Runx是含有Runt同源区的多功能转录因子，不仅可与DNA结合，而且也可通过蛋白－蛋白间相互作用的方式以共调节子（comodulator）的形式调控基因转录。Runx-2（也称Cbfa-1）为Runx家族成员，Runx-2在成骨细胞功能和分化过程中起着中枢性的调节功能，可启动一系列成骨细胞功能相关分子表达。同样，Runx-2在软骨细胞分化和软骨内骨化过程中也发挥着不可或缺的调控作用。

Runx-2基因缺失小鼠，除未见矿化骨基质外，Ihh和X型胶原（分别为前肥大型和肥大型软骨细胞标志）的表达同样受到抑制，增殖型软骨细胞向肥大型方向分化阻滞。导入Runx-2基因后，抑制效应可获得部分缓解，并在一定程度上促进生长板软骨细胞分化，这说明Runx-2在非肥大型软骨细胞向肥大型分化阶段发挥正调控作用。有学者推测，Runx-2可能和已知的Ihh/PTHrP途径相互配合，调控软骨细胞分化。Runx-2也可作为共调节子与Smad分子共同介导BMP-2诱导的成软骨作用。

2. Runx-2与软骨内骨化 Runx-2在软骨发生早期呈低水平表达，在永久性软骨组织中几乎不能测到，但在生长板肥大型软骨细胞中却有较高水平表达，说明其有可能调控肥大型软骨细胞的进一步分化。

采用Cbfa-1和显性负Cbfa-1转基因鼠的研究发现：①Cbfa-1转基因鼠的永久性软骨组织失去其表型，进入软骨内骨化过程，而DN-Cbfa-1转基因鼠的软骨组织则获得了永久性软骨组织表型；②外源性Cbfa-1能促进软骨细胞向肥大型分化，并刺激肥大型软骨细胞表达血管内皮细胞生长因子（VEGF），诱导血管侵入，促进软骨内骨化；③在DNCbfa-1转基因鼠，软骨细胞表达关节软骨细胞标志韧黏素（tenascin），并且在多个部位出现永久性软骨细胞标志，而在Cbfa-1转基因鼠未见tenascin表达，同时，关节形成的早期标志GDF-5的表达也被抑制。因此认为，永久性软骨细胞也有潜力进入软骨内骨化过程，只是由于其他因子的作用抑制了Cbfa-1的表达，而使其获得永久性表型。在一些关节退行性疾病，可能正是这种抑制因素失控，导致永久性软骨细胞进一步向成熟方向分化引起。

3. Osterix与软骨内骨化 Chiasto等在研究了Cbfa-1的作用后推测，在其下游可能还存在一种转录因子和Cbfa-1共同决定成骨细胞分化。之后不久，Kazubisa等就发现了一种新的含锌指结构的转录因子Osterix （Osx）在Cbfa-1下游对骨形成发生作用。

在胚胎发生过程中，Osx主要限于软骨原基周围表达，在孕15.5d主要在骨领和与骨小梁形成有关的细胞表达，Osx基因敲除小鼠，Cbfa-1表达水平正常，但无成骨细胞标志分子表达，表达Cbfa-1的细胞并不能分化为成骨细胞。而且，X型胶原、Ihh表达俱正常，软骨原基内同样可见到有功能的破骨细胞和血管侵入，只是无矿化骨基质和成骨细胞生成。反之，敲除Cbfa-1基因则未见Osx表达，同时，肥大型软骨细胞的生成和血管侵入俱受限。因此，Cbfa-1表达的细胞仍具向成骨细胞和软骨细胞的双向分化潜能，Osx位于其下游调控成骨细胞生成。

4. 成骨细胞的迁移和募集机制 成骨细胞可通过接触趋化（haptotaxis）机制聚集、黏附于目标基质，部分生长因子则可协同成骨细胞趋化至目标附近。目前认为，成骨细胞主要通过以下两种机制募集。

（1）HB-GAM/N-Syndecan途径介导的成骨细胞募集：HB-GAM也称多向分化因子（pleiotrophin），是一种富含赖氨酸和半胱氨酸残基的细胞外基质蛋白，在进化方面较保守，人、鼠、牛、鸡之间有95%的同源性，与肝素结合生长因子-Midkine，有50%的同源性，已发现，它在神经系统发育中有重要作用。

Syndecan是一类跨膜硫酸肝素蛋白多糖，目前已克隆出4种亚型，其中Syndecan-3最初从施万细胞中克隆，因此也称NSyndecan。N-Syndecan与细胞外的HB-GAM通过硫酸肝素链结合后，引起细胞内的骨架结构重排，最终导致细胞移动，这一途径最早由Hung等描述，认为其在神经轴索的延伸中发挥作用。

Shinji等的实验证实了这一途径同样也是介导成骨细胞募集的主要机制：①在胚胎期，HB-GAM在软骨基质大量表达，后者则是软骨内骨化的模板，将有大量的成骨细胞募集、黏附。②迁移中的前成骨细胞、成骨细胞内N-Syndecan高度表达，在HBGAM高度表达的区域两种分子表达重叠，而在完全成熟的骨组织区域，成骨细胞不表达N-Syndecan。③出生后，HB-GAM主要在形成次级骨化中心的软骨基质内密集表达，同时，在一些板层骨的骨细胞内也有选择性表达，这些区域都与成骨细胞募集有关。电镜分析发现，表达N-Syndecan的细胞都表现为增殖分化能力旺盛，大多是移动中的前成骨细胞。④HB-GAM转基因的小鼠表现为骨皮质明显增厚，为正常的147.4%，但骨髓腔结构正常，骨的大体形态结构也正常。

（2）Midkine和血小板衍生生长因子（PDGF）对成骨细胞募集的协同作用：Midkine（MK）是一类肝素结合生长因子，以前的研究认为其在神经轴突的生长及肿瘤的发病中发挥作用。MK可诱导成骨细胞募集，这一作用可能通过细胞内有丝分裂原激动蛋白激酶（MAPKs）和PI3激酶介导，同时发现，MK和PDGF在诱导成骨细胞募集方面有协同作用。这种情况主要见于骨折修复时，因为此时局部MK和PDGF聚集的水平都显著增高。但在骨骼发生过程中这一途径是否发挥重要作用尚有待深入研究。

5. 缺氧诱导因子（HIFs）在骨发生、发育微环境中的重要性　HIFs于1992年被发现，作为氧感应机制通路中的重要环节，备受关注，研究内容主要涉及心血管、呼吸、神经、肿瘤等领域，近年来渐渐受到骨科领域的重视。HIFs是组织细胞在低氧状态下由激活基因所编码的转录因子，包括三种亚型，现在的研究主要集中于HIF-1及其氧感应元件HIF-1α。HIF-1α极不稳定，在正常氧条件下，半衰期不到10min，与其降解有关的结构域称为氧依赖降解结构域（ODD）。在骨的发生、发育过程中，无论是长骨形成的软骨内化骨形式，还是扁骨形成的膜内化骨形式，其血管的侵入是引起确定型间充质细胞增殖、分化以致骨发生始动的标志。在软骨内成骨过程中，间充质性软骨前体细胞分化为软骨细胞、分泌软骨基质。随软骨细胞的进行性增殖和软骨基质的增加，软骨细胞肥大、终极性分化乃至凋亡。正常情况下，软骨性破骨细胞侵入生长板的肥大区并形成陷窝，血管侵入陷窝、血管周围的成骨细胞前体细胞替代残迹并分化为成熟、矿化性的成骨细胞。膜内化骨过程的特征是毛细血管侵入间充质带，间充质细胞发育转化为前成骨细胞和最终被基质包埋的成骨细胞。因此，血管的侵入，是骨发生的标志性事件。

针对与软骨雏形骨化中心处或生长板血管的侵入有直接关联的HIF-1α的研究发现，软骨细胞外基质呈梯度性缺氧状态，HIF-1α表达，其中央部位尤甚；软骨细胞HIF-1α基因条件性敲除后，生长板中央处软骨细胞死亡；HIF-1α的表达是维持生长板软骨细胞生命活动的必需条件。提示，适量水平的HIF-1α可使软骨细胞尤其是早期肥大软骨细胞存活期延长而使基质钙化逐渐弥散，当进行性升高的HIF-1α达一定程度，便会通过信息递呈或VEGF及其受体FIt-1（fms-like tyrosine kinase）、KDR（kinase domain region）介导，诱导血管侵入，有效的屏障作用因此而丧失，HIF-1α被降解，如此交替。这有可能是透明软骨雏形和出生后生长板软骨细胞分裂、增殖、肥大、变性、坏死和软骨基质的钙化，有序而规律的主要调节机制。