血型确证试验

1．检验目的

确证初筛RhD血型为阴性的献血者RhD抗原表达情况，防止正常D、变异D（弱D、不完全D、不完全弱D、放散D）被误定型为RhD阴性。

2．检验原理

通常情况下只有初筛为RhD阴性的献血者需要做确证试验，以确保将真正RhD阴性的血液输给需要RhD阴性血液的患者，而临床初筛的为RhD阴性输血患者一般不做确证试验，而是直接输注RhD阴性血液成分。献血者RhD初筛一般使用单克隆IgM抗体或IgM+IgG抗体（纸板法或玻片法）进行检测（盐水法），可能出现弱D、不完全D、不完全弱D的漏检。RhD血型确证试验采用三个厂家、三个批号、至少两种试剂中含有IgG类抗D抗体，通过卡式抗人球蛋白法进行D抗原检测，可以最大限度减少D抗原的漏检，确定受检者RhD血型。

3．适用范围

适用于献血者RhD血型确证试验。

4．设备性能参数

参见DiaMed ID离心机、DiaMed ID孵育器、B 600-A型低速离心机使用说明书。

5．器材与试剂

5.1 器材：DiaMed ID离心机、DiaMed ID孵育器、B 600-A型低速离心机、塑料软试管、塑料硬质试管（75 mm×12 mm）、试管架、记号笔；

5.2 试剂：DiaMed微柱凝胶Coombs卡、2号稀释液、生理盐水、三个厂家不同来源的抗D标准血清（至少两种试剂是IgG类或含有IgG类抗体）、3系、10系或16系谱细胞（用于阴阳性对照）。

6．样本要求

供者标本：枸橼酸盐抗凝，全血量≥3 ml，经B 600-A型离心机1 760 r/min离心5 min，离心后无溶血、无凝块及明显乳糜。

7．校准步骤

参照DiaMed ID离心机、DiaMed ID孵育器、B 600-A型低速离心机使用说明书中的校准要求执行。

8．操作程序

8.1 取受检者（常规纸板法鉴定为RhD阴性）的红细胞，经生理盐水洗涤3次，取压积红细胞10μl加入2号系统稀释液1.0 ml配成1%的红细胞悬液。

8.2 取三个厂家不同来源的抗D标准血清，一般组合形式为单独IgM抗体、IgM+IgG抗体、单独IgG抗体。

8.3 在微柱凝胶卡上依次标记IgM抗体检测孔、IgM+IgG抗体检测孔、IgG抗体检测孔、自身对照孔、阴性对照孔和阳性对照孔。

8.4 在IgM抗体检测孔、IgM+IgG抗体检测孔、IgG抗体检测孔和自身对照孔中分别加入已配制好的受检者1%的红细胞悬液50μl，再分别在对应的孔中加入25μl相对应的标准血清抗体，在自身对照孔中加入受检者血清25μl。分别在阴性对照孔和阳性对照孔中加入1%阳性对照细胞和阴性对照细胞各50μl，再分别加入IgG抗D抗体25μl。

8.5 使用DiaMed ID专用孵育器37℃孵育15min。DiaMed ID专用离心机85 r/ min，离心10 min。

8.6 结果判读：自身对照、阴性对照结果为阴性，阳性对照结果为阳性说明试剂和反应体系有效，检测孔出现红细胞凝集在上层或中间层的为阳性，全部沉积在底层的为阴性。自身对照、阴性对照结果为阳性和（或）阳性对照结果为阴性时说明试剂和（或）反应体系失效，需要更换试剂和（或）反应体系后重复试验。

8.7 三批试验结果有一批或多批为阳性的，结果即报告应为：D变异型。相应血液应作为RhD阳性血液输给RhD阳性患者，而献血者自身在将来输血时应作为RhD阴性患者对待。

8.8 检验结果的确认　确证试验结果应由实验室负责人或授权人员进行确认签字，出现阳性结果应将其所献血液视为RhD阳性血液使用，阴性结果将其所献血液视为RhD阴性血液使用。

9．质量控制

9.1 室内质量控制

通过每批次的阴阳性对照和自身对照试验实现。

9.2 室间质量评价

目前尚无统一的室间质量评价活动。

10．干扰因素

10.1 离心条件影响实验结果，最好使用血清学专用离心机，以防假阳性或假阴性结果出现；

10.2 当用未经洗涤的细胞作试验时，样本中的自身凝集和异常蛋白质可能引起假阳性结果。

11．结果计算及测量不确定度

不适用。

12．生物参考区间

不适用。

13．检验结果可报告区间

不适用。

14．警告/危急值

D变异型相应血液应作为RhD阳性输给RhD阳性患者，而献血者自身在将来输血时应作为RhD阴性患者对待。

15．实验室解释

D变异型相应血液应作为RhD阳性输给RhD阳性患者，而献血者自身在将来输血时应作为RhD阴性患者对待。实验室应该向献血者说明D变异型作为供、受者时的区别和注意事项。

16．安全性预警措施

16.1 实验室及工作人员一般安全防护措施参见《实验室安全与卫生管理程序》。

16.2 发生血液标本溢出时，应参照《实验室消毒与清洁程序》对污染的环境进行消毒处理。

16.3 操作人员发生职业暴露时，应参照《实验室职业暴露预防与处理程序》及时进行相应处理。

16.4 在仪器运转过程中，勿触及样品针、移动的传输装置等，避免造成人身伤害。禁止触摸仪器密封面板内的电路，防止造成电击损伤。

16.5 对突发传染性疾病的血液标本应启动特殊的安全防护程序。

17．变异潜在来源

D变异型，包括弱D、部分D、放散型D等均可出现RhD初筛试验结果阴性、确认试验结果阳性。

18．Rh血型确证试验特别注意事项

18.1 RhD抗血清质量应符合要求，用毕后应放置冰箱保存，以免细菌污染。室温放置时间过长或反复冻融会导致抗体效价降低，如出现浑浊或变色则不能使用。18.2 加样时应先加红细胞悬液，然后再加血清。

19．报告时间

血液采集当天完成试验并修改对应血液信息。

20．参考文献

[1] 抗D标准血清、DiaMed微柱凝胶Coombs卡使用说明书．

[2] 临床输血技术规范．中华人民共和国卫生部医政司．北京，2000．

[3] 中国输血技术操作规程（血站部分）．中华人民共和国卫生部医政司．天津，

1997．