原花青素含量的测定

1.分光光度法

1)原理

原花青素(也称缩合单宁)是黄烷-3-醇的寡聚体与多聚体，属多酚类化合物。与其他酚类化合物不同，黄烷醇(缩合单宁、单体、双体等)在酸性介质中可与香草醛反应，生成在500nm波长处有最大吸收的有色物质，可通过比色测定其含量。

2)仪器

分光光度计等。

3)试剂

①香草醛、甲醇、浓盐酸均为分析纯;

②4%香草醛甲醇液;

③原花青素标准使用液: 将原花青素标准品溶于蒸馏水，配制成1mg/m L的储备液，将储备液稀释为0.01～1mg/m L的标准使用液，标准使用液应与测定当天配制。如无提纯的原花青素，可用儿茶素代替，配制方法同上。

4)操作步骤

(1)样品的处理

①植物材料的处理: 经4倍体积的丙酮-水(7+3)或者经60%甲醇提取，在40℃以下减压蒸馏去除有机溶剂，水相再经乙醚洗涤后定容。

②冰冻干燥的固体原花青素制剂的处理: 直接溶于水(先加少量甲醇助溶)制成原花青素液。原花青素液于5℃下暗环境中保存备用。

(2)样品的测定

用锡箔将试管包裹严，仅留管口用于加样。向管内加入试样0.5m L，再加3.0m L4%香草醛甲醇液混合，然后加入1.5m L浓盐酸，彻底混匀，室温下显色15min。也可在暗环境中进行以上操作，最后在500nm波长处测定吸光度。

按上述操作步骤制得标准曲线，根据标准曲线测得，0.1mg原花青素在500nm波长处的吸光度为0.55。

5)结果计算

式中: A500nm——样品在500nm处的吸光度值;

V——试样稀释体积(倍数);

0.55——0.1mg原花青素在500nm波长处的吸光度为0.55;

m——样品的质量，g。

6)说明及注意事项

①反应试管应用清洁剂浸泡24h，彻底洗涤干净。

②进行比色时，用水作空白。

③试样中原花青素的含量较高时，应从香草醛存在下所测得A500nm值中减去无香草醛时所测的吸光度值。

④显色液应避光防置。

⑤500nm处的OD值应控制在3以下。

2.铁盐催化比色法

1)原理

原花青素是植物王国中广泛存在的一类黄烷-3-醇衍生物的总称，因聚合度的不同以及单体的构象或键合位置的不同可形成多种化合物。原花青素氧化后能生成红色的花青素。通常用铁盐催化比色法测定总量，利用硫酸高铁铵的催化作用，以盐酸水解将之转变为红色的花青素，花青素在550nm处有最大吸收峰，比色测定其吸光值，与原花青素化学对照品比较，便可定量计算出样品中原花青素的含量。

2)仪器

①水浴锅;

②分光光度计。

3)试剂

①无水乙醇、正丁醇、浓盐酸、硫酸高铁铵均为分析纯;

②20%硫酸高铁铵: 取10g Fe NH4(SO4)2·12H2O，用2mol/L盐酸溶解定容至50m L;

③反应混合液: 取正丁醇、浓盐酸、20%Fe NH4(SO4)2溶液按85 5 0.4(体积比)比例混合均匀，备用;

④标准溶液的配制: 准确称取经干燥的原花青素化学对照品52mg(精确至0.0001g)，用无水乙醇溶解，并定容至100m L，制得浓度为0.52mg/m L的标准溶液。再用无水乙醇稀释配制成浓度为0μg/m L，26.00μg/m L，52.00μg/m L，104.00μg/m L，208.00μg/m L， 312.00μg/m L，416.00μg/m L的标准系列使用液。

4)操作步骤

(1)标准曲线的绘制

分别移取上述不同浓度系列使用液1.00m L置于10m L刻度试管中，加入9m L上述反应混合液，置于沸水浴中加热，待水浴温度至(99±1)℃开始计时，并塞紧塞子(勿摇匀)，准确加热40min后，立即取出，用冰水快速冷却至室温，以正丁醇定容至刻度线，塞紧后充分摇匀，在550nm处以空白管调零扣除背景，测定吸光值，并以最小二乘法绘制原花青素浓度—吸光值曲线。

(2)待测样品液的制备

精确称取胶囊内容物0.5～1.0g，加无水乙醇(遇醇溶性较差的样品，可加入少量的蒸馏水促进溶解)，溶解(对于软胶囊取整粒称重后再用小刀割破，用超声波以乙醇多次提取)，定容至100m L，摇匀，即得到样品储备液。再移取0.5～1.0gm L储备液(根据提取物浓度高低确定具体的量，使待测液原花青素浓度在0.05～0.20mg/m L范围内)定容至50m L，摇匀得到待测样品液。

(3)样品测定

移取1.00m L待测液依照上述标准曲线绘制同样操作，测定吸光值，根据标准曲线，计算原花青素的含量。

5)结果计算

式中: c——根据工作曲线计算得到的原花青素的含量，μg;

V1——待测样品液的取样体积，m L;

V2——样品溶液的体积，m L;

m——样品称取的质量，g;

W——样品的含水量，%;

n——样品溶液稀释倍数。

6)说明及注意事项

①准确性: 添加浓度为52.00～208.00μg的标准(OD550在0.157～0.520范围内)，3次测定平均回收率在90.64%～109.50%。

②精密度: 同一样品测定8次，相对标准偏差为2.13%～2.98%。

③干扰物质: 比较紫外分光光度法，本法干扰物质少，常见的维生素、芦丁、类胡萝卜素、食品抗氧化剂、各类油脂类基本未见明显干扰，由于多糖、蛋白质不溶于无水乙醇，故不会干扰测定。