一、目的及要求
1.了解高效液相色谱仪（HPLC）的结构和原理，掌握高效液相色谱的操作要点与外标法。
2.了解植物氨基酸液的制备方法。
3.掌握高效液相色谱仪（HPLC）对氨基酸进行分析的方法。
二、实验原理
高效液相色谱法是继气相色谱之后，于20世纪70年代初期发展起来的一种以液体作流动相的新色谱技术。它适用于分离分析稳定性差、相对分子质量（400以上）大、沸点高的物质及具有生物活性的物质。高效液相色谱法具有高柱效、高选择性、分析速度快、灵敏度高、重复性好、应用范围广等优点。该法已成为现代分析技术的重要手段之一，目前在化学、化工、医药、生化、环保、农业等领域获得广泛的应用。高效液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统等五大部分组成。
分析前，选择适当的色谱柱和流动相，开泵，冲洗柱子，待柱子达到平衡而且基线平直后，用微量注射器把样品注入进样口，流动相把试样带入色谱柱后，根据被测物质在色谱柱中的分配系数的不同进行分离，分离后的组分依次流入检测器的流通池，最后和洗脱液一起排入流出物收集器。当有样品组分流过流通池时，检测器把组分浓度转变成电信号，经过放大，用记录器记录下来就得到色谱图。色谱图是定性、定量和评价柱效高低的依据。
三、仪器与试剂
1.仪器
Agilent 1200液相色谱，色谱柱（4.6 mm×150 mm），ODS（5μm），紫外可见检测器，定量管（20μL），微量注射器（50μL），精密酸度计，超声波振荡器，研钵，0.45μm滤膜（水系），减压抽滤系统，微量离心过滤管，烧杯，量筒，容量瓶及移液管等
2.试剂
衍生液：异硫氰酸苯∶甲醇∶三乙胺∶水（体积比）＝1∶7∶1∶1
正己烷
氨基酸标样
乙腈、乙酸、乙酸钠
以上试剂中乙腈为色谱纯，水为二次蒸馏水，其他为分析纯
四、实验步骤
1.柱前衍生步骤
（1）将200μL衍生液加入200μL氨基酸标样或样品中，振荡使混合均匀，室温放置1 h。
（2）反应液中加入400μL正己烷，充分振荡后放置使分层。
（3）取下层溶液用一次性滤膜过滤器（0.45μL）过滤。
（4）取滤液5μL注入HPLC。
2.分离条件
（1）色谱柱：Shim-pack VP-ODS 4.6 mm×15 cm。
保护柱：Shim-pack GVP-ODS 4.6 mm×1 cm。
（2）流动相
A液：0.1 mol／L乙酸钠pH 6.50（用乙酸调整，500 mL乙酸钠中约加2滴乙酸）。
B液：乙腈／水＝4／1（体积比）。
（3）流量：1 mL／min。
（4）柱温：36℃。
（5）检测波长：254 nm。
（6）梯度洗脱程序，见表8-4。
表8-4 梯度洗脱程序
进样量可在pmol级别。为取得较高的重现性，建议在nmol级别进样，由于氨基酸相对分子质量在130左右，故通常进样浓度为100～1 000μg／g，对几个μmol／mL的样品可直接进行柱前衍生，太高浓度的样品最好稀释10～100倍再分析。
3.样品处理
（1）液体样品：如清凉饮料、酒精饮料、咖啡溶液等，酱油、醋需稀释10倍以上。用SEP-PAK C18净化柱处理，收集馏出液，经0.45μL微孔滤膜过后，备用。
（2）固体或半固体样品：如水果、蔬菜、腌制的农产品、蛋黄酱、咖啡等，将样品捣碎、均质后，加入一定量的0.01 mol／L NaOH溶液提取，经离心分离或过滤后收集提取液，用SEP-PAK C18 Cartridge净化柱处理，收集馏收液，经0.45μm微孔滤膜过滤后，备用。
4.测定
注入氨基酸标准系列溶液各10μL，进行高效液相色谱分析；同时注入试样溶液10μL，进行高效液相色谱分析，以保留时间定性，以峰高或峰面积结合标准曲线定量。
五、注意事项
1.为保证试样的代表性，可任取固体样品，研细、混匀、干燥、称量，再从中称取1／10质量进行实验。
2.流动相、试液均应以0.45μm滤膜减压过滤，以免堵塞进样阀、毛细管和色谱柱。
3.按照上述步骤可以确定试液色谱图中每个峰的归属并测定其含量，若配制标准溶液，则可一次测定17种氨基酸的含量。
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