抗生素使用效果的评价方法

水生动物用抗菌药物是指用来防治水生动物由细菌感染的一类药物，对病原菌具有抑制或杀灭作用。在控制水生动物传染性疾病中起着举足轻重的作用。

根据抗菌药的来源，可分为抗生素和化学合成抗菌药。抗生素是指微生物（细菌、真菌、放线菌）在代谢过程中产生的对其他特异性微生物具有抑制、杀灭作用的微生物次级代谢产物，包括天然抗生素和半合成抗生素，养殖生产中常用药物为青霉素、氨基糖苷类、四环素类、酰胺醇类等。化学合成抗菌药是指完全由人工合成的抗细菌及抗真菌药，养殖生产中常用的有磺胺类、喹诺酮类等。根据药效学特点，抗菌药可分为两大类：第一类为浓度依赖性抗菌药，如氨基糖苷类、喹诺酮类和两性霉素B等，其杀菌作用与浓度密切相关，即血药峰浓度越高杀菌力越强，但其剂量不能超过最低中毒剂量。第二类为非浓度依赖性或时间依赖性抗菌药，如 β-内酰胺类、大环内酯类、林可霉素类等，其杀菌作用与血药峰浓度的关系并不密切，而与大于对病原菌最低抑菌浓度(MIC)的时间相关。

抗生素所发挥的积极作用主要体现在防治水生动物疾病、促进生长、节约营养成分等方面。尤其是抗生素的应用有效控制了许多疾病的发生，促进了水产养殖业的发展。但是，由于抗生素的不断使用容易产生耐药菌株、存在药物残留以及容易破坏水生动物微生态平衡，一方面使得水产养殖疾病越来越难治；另一方面水产品质量安全得不到保证。因此，为了人类的健康和水产养殖业的可持续发展，必须充分认识到抗生素在水产养殖中所带来的副作用。抗生素的副作用集中表现在以下几个方面：

（1）耐药菌株的产生 某种曾经有效的抗生素在生产上低剂量、长时间使用后，会出现药效减弱或完全消失的现象，这是因为病原菌对抗生素产生的抗性或耐药性，即产生了耐药菌株。耐药菌株的产生使得生产上用药量越来越大，药效越来越差，既增加了生产成本，又增加了防治难度。耐药菌株的产生同时也对人类的公共卫生构成威胁。

（2）在水产品中产生药物残留 抗生素使用后进入水生动物的血液循环，大多数会被排出体外，极少数则会残留在体内组织中，并且随着多次使用在体内蓄积起来。抗生素的残留在影响人类身体健康的同时，也会影响水产养殖业的发展。

（3）破坏微生态平衡 水是水生动物赖以生存的环境，其中有许多有益微生物，如光合细菌、硝化细菌等；水生动物肠道里也有大量的有益微生物，如乳酸杆菌、部分弧菌等。它们在维持水环境的稳定、水生动物代谢平衡中起着关键性的作用，成为水生动物体内外微生态平衡中的重要组织成部分。抗生素的使用在抑制或杀灭病原微生物的同时也会抑制这些有益微生物，使水生动物体内外微生态平衡被破坏，导致微生物恶化或消化吸收障碍而引起新的疾病。

（4）对免疫系统有抑制作用 抗生素对免疫系统的作用主要表现为对吞噬细胞的抑制。一是抗生素直接影响吞噬细胞的功能；二是通过影响微生物而影响吞噬细胞对微生物的趋化、摄取和杀灭等功能。

总之，抗生素作为水产养殖中重要的抗细菌性疾病的药物，具有不可替代的作用，因此必须有针对性进行使用效果的评价，通过科学、合理、安全地用药，防止或延缓其耐药性的产生，防止在水生动物体内的残留和对养殖环境的破坏。

水生动物用抗菌药物的药效评价既用于探索和评价治疗水生动物疾病的种类和用药剂量的一系列试验，其目的是要体现抗菌药物自身的特点，又要最终确认药物的安全性和有效性，查明其杀灭或抑制病原菌生长的能力，确认其对疾病的治疗作用。

抗生素使用效果评价方法主要是室内的药物有效率（或药物保护率）测定和田间的生产性验证。

一、抗菌药物实验室有效率测定

水生动物用抗菌药物药效试验的建立主要包括环境条件的说明，试验用水生动物的选择，受试抗菌药物的说明，试验的分组情况，给药途径、间隔时间的确定以及观察时间、指标的确定等。

1.环境条件

水生动物药效学测定的养殖水体（如水槽）应能保持环境稳定、不受外界环境突然变化或污染影响，相对独立。试验水体必须能满足水生动物的生理要求，水体积不小于200升，试验水生动物密度应控制在不影响其正常生理活动范围内。

试验用水应符合GB11607－89《渔业水质标准》要求，自来水应曝气48小时，天然水应自然沉淀24小时后过滤。一般应在以下规定的条件下进行测定：

药效测定水质要求

2.用于评价的水生动物

根据评价药物的具体要求，合理选择相应种类的水生动物，选用动物应尽量有代表性，其来源应为具有水产养殖生产许可证单位生产的合格品种，要求外观活泼、健康、无外伤、摄食正常、个体大小均匀，年龄适宜且属于同一群体。有条件的应首先选用标准实验动物或SPF动物。试验前应在室内环境暂养7～10天，以适应环境。

选用的试验水生动物应尽可能具有代表性。但并不需要用每一种水生动物进行试验，而是可以选择以下分类中的代表性水生动物进行试验，一般可以将水生动物分为四大类，即冷水性淡水动物，温水性淡水动物，冷水性海水动物，温水性海水动物。如果一种药物可以有效地治疗某类水生动物中一种水生动物的某种疾病，那么通常可以认定这种药物可以有效地治疗这类水生动物中所有水生动物的这种疾病；如果一种药物可以有效地治疗每类水生动物中一种水生动物的某种疾病，那么通常可以认定这种药物可以有效地治疗所有水生动物的这种疾病。

试验用水生动物数量规定如下：鱼类幼体试验数量每个试验组不小于30尾，成体不小于20尾；虾、蟹、贝类幼体试验数量每个试验组不小于40只，成体不小于30只；龟、鳖、蛙类幼体试验数量每个试验组不小于20只，成体不小于10只。

3.试验药物

药物及来源 用于药效评价的药物应有完整的产品质量标准，有合乎规定格式的说明书，如生产厂家、生产批号、含量（或规格）、用法用量、保存条件及配制方法等。

对照药物及来源 对照药物应当是已经正式批准上市或有资料证明其疗效确切，与用于评价药物具有可比性的同类或同效药物，并力求与评价药物的适应症、给药途径、试验方法、检测指标等保持相似或相同。

4.感染方案

菌种 人工感染用的菌种应为具有代表性的标准致病菌种或专业机构鉴定保藏的菌种。如果采用自然感染病例分离的菌株，应详细记录其来源，并应经有资质的部门鉴定方可用于试验。攻毒前需测定其包括受试药物和对照药物（但不限于受试药物和对照药物）在内的MIC，必要时测定其MBC。

感染方法 将标准菌株活化，配置一定浓度的菌液。感染前须进行预备试验，确定感染途径和感染量，感染量应为受试动物的最小致死量或能使80%以上感染动物出现明显发病症状的剂量。也可采用自然感染水生动物进行同居感染方式，特殊情况下可选择自然病例进行试验。

病例的确诊 人工感染的病例需通过发病过程和临床症状确诊，证明水生动物已感染接种致病菌并发病后才能作为试验病例。通过临床症状不能确诊的，可通过对致病菌的分离鉴定进一步确诊。若采用自然感染的水生动物，须进行病原菌鉴定。

5.试验分组

应采用随机分组原则，试验组数取决于抗菌药物的类型、疾病的特征以及有效剂量的筛选等因素，试验一般应满足如下要求：

①健康对照组 即不感染不给药对照组。

②阴性对照组 即感染不给药对照组

③阳性对照组 即药物对照组，剂量应为临床推荐剂量。如受试药物为复方制剂，药物对照组应根据组方中各主要成分，分别设单方药物的推荐剂量对照组。需要注意的是，在评价受试药物时，并不一定要求其药效全面比对照的标准药物优良，即使只有某一方面或某几方面具有已知同类药物不及的独特药效，则就可以说明该受试药物具有的价值。

④药物试验组 根据受试药物的药代动力学和体外抑菌试验结果初步确定给药剂量或药品注册申请人推荐的有效剂量，至少设高、中、低三个剂量组，其高剂量最好接近最大耐受剂量，中、小剂量根据水生动物有效剂量的上下限范围选取，中剂量一般为推荐剂量。

6.给药方案

给药途径 药效学试验中的给药途径的不同，将直接影响其试验结果的客观性与真实性。应当明确表明试验抗菌药物的给药途径和具体给药方法，给药方法应结合药物的特点和作用方式而决定采取口服、注射还是浸泡的给药方式。注射要标明注射部位，口服一般采用口灌、混饲等。

预防试验为先给药再感染。治疗试验为先感染，急性传染病在感染后2～4小时即可给药，慢性传染病应出现典型临床症状后再开始给药；自然感染病例在病因确诊后开始给药。

给药间隔时间 应根据受试药物特性和药代动力学、体外抑菌试验结果合理制定给药间隔时间。

通常浓度依赖型抗菌药宜每日给药一次，因一次性较大剂量给药可造成较高的最大血药浓度（Cmax），从而使Cmax与最低抑菌浓度（MIC）的比值达到最大，产生最佳的杀菌作用和临床疗效；而时间依赖型抗菌药宜持续或一日多次给药，使在感染部位的药物水平持续大于MIC。

抗菌药药物浓度低于MIC时只能对病原菌产生干扰作用而不能将之清除，并可能产生以变异耐药菌株为主的菌群，容易从这些具有低水平耐药性的菌群中选择产生高度耐药菌株。因此，应认真考虑采取适当的给药间隔以尽量缩短低于有效浓度的时间，防止产生耐药性。

7.观察时间

结合受试抗菌药物的药效学和药代动力学特性、受试水生动物、药效试验研究方案等选择观察时间点和观察时间。一般要求在停止给药后继续观察时间不得少于7天。

8.观察指标

试验开始后连续观察和记录各组受试水生动物的发病时间、发病数、死亡时间、死亡（成活）数或症状出现（消失）数等，必要时进行受试水生动物病理检查，以确认受试动物是否因接种病原菌感染发病，如因其它原因死亡的，统计时剔除。

9.效果评价

抗生素的使用效果以有效率（保护率）进行评价，与对照组进行比较，统计药物的预防有效率和防治有效率。有效率在85%以上为显效，60%～85%为有效。即如果抗菌素的预防和治疗有效率低于 60%，则认为该药对防治由试验病原菌引起的细菌性疾病无效。需要注意的是，在进行效果评价时，应对结果进行定性和定量的统计分析。常用的生物统计方法有t检验、x2检验，应根据实际情况进行选用。

二、抗菌药物养殖池塘药效评价

养殖池塘药效评价在养殖水体中进行的药物对病原微生物施药效果的试验，这是确定药物能否在生产上大面积推广应用很重要的方法，它是验证药物产品质量的重要手段。养殖池塘药效评价应在深入调查研究和室内药效和安全性试验的基础上进行，且具有针对性、典型性和科学性。

水生动物用抗菌药物田间药效评价主要包括试验池、受试水生动物的选择、试验药物的说明、给药方案以及观察指标的确定等方面的内容。

1.试验池要求

田间试验须安排在历年发病地区，饲养规范，实验条件能得到有效控制的养殖场进行。每个试验池应是相对独立的养殖池，并配备必要的养殖工具设施。试验池要求位置、面积、环境条件基本相似，变异值应小于10%。每个养殖池塘面积不应小于1亩。试验水质应符合GB11607－89《渔业水质标准》，一般应在以下规定的条件下进行。评价使用池数量不少于5个，平行试验可设在多个渔区。

水温 淡水10～30℃，海水15～30℃；

溶解氧 ≥4.0毫克/升；

p H值 淡水6.5～8.5，海水7.5～8.5；

氨氮 ＜0.3毫克/升；

亚硝酸盐氮 淡水＜0.1毫克/升；

盐度 淡水≤0.5，海水1.5～7.5。

2.受试水生动物

品种 应与受试药物拟推荐应用范围相一致。不同靶动物品种和不同适应症应分别进行田间药效试验。

池塘 应选择水源、水深、透明度、氨氮、亚硝酸盐氮、面积、放养密度、养殖品种、历史条件和病史基本一致的养殖池塘。

试验动物数 水生动物用抗菌药物田间药效试验用自然感染的动物进行试验，每组水生动物数量规定如下：鱼类幼体试验数量不小于200尾，成体不小于100尾；虾幼体试验数量不小于2000只，成体不小于1000只；蟹、贝类幼体试验数量不小于400只，成体不小于200只；龟、鳖、蛙类幼体试验数量不小于200只，成体不小于100只。

3.试验药物

试验药物 用于药效评价的药物应有完整的产品质量标准，有合乎规定格式的说明书如生产厂家、生产批号、含量（或规格）、用法用量、保存条件及配制方法等。

对照药物及来源 对照药物应当是已经正式批准上市或有资料证明其疗效确切，与用于评价药物具有可比性的同类或同效药物，并力求与评价药物的适应症、给药途径、试验方法、检测指标等保持相似或相同。

4.病例的确诊

田间药效试验一般选择自然感染病例，可通过发病过程、临床症状、病理剖检、致病菌的分离鉴定以及血清学诊断来确诊，证实为试验所需致病菌感染的发病动物才能作为试验病例。

5.试验分组

田间药效评价的试验组数取决于抗菌药物的类型和疾病的特征，也可根据实验室药效试验的结果来确定，药效治疗试验一般应满足如下要求：阴性对照组即发病未给药对照组（在可能情况下）。阳性对照组即药物对照组。评价药物试验组按推荐剂量，如果推荐剂量是一个范围，可选择中间剂量为受试药物试验组，必要时选择推荐剂量的上限和下限各设1个剂量组。

药效预防试验一般应满足如下要求：空白对照组即未发病未给药组。阳性对照组即药物对照组。药物试验组按推荐剂量。

6.给药方案

根据评价药物的推荐给药途径和给药方案进行，包括开始给药时间、给药剂量、时间间隔和持续时间等。

7.观察时间

治疗试验在停止给药后继续观察不得少于7天，预防试验在停止给药后继续观察不得少于15天。

8.效果评价

试验开始后连续观察和记录各组受试水生动物的发病时间、发病数、死亡时间、死亡（成活）数或症状出现（消失）数等，必要时，进行受试水生动物组织病理学检查，以确认受试动物是否因试验所需致病菌感染发病，如因其它原因死亡的，统计时剔除。

抗菌药物使用效果以有效率（保护率）进行评价，与对照组进行比较，有效率在 85%以上为显效，60%～85%为有效。

9.注意事项

试验的可靠性 在整个评价过程中，由于选择的对照药物是有效药物，即疗效相对较为稳定，因此药物对照组必须有效，否则需重做药效评价。

减少系统误差 在田间药效评价中，只有减少试验误差，提高试验的精确度，才能进行正确有效的比较。在田间药效试验中要减少试验误差，就必须对试验误差来源进行分析，通过试验设计加以克服。在药效评价过程中减少试验误差应注意以下几个方面：

（1）重复次数越多，其平均值就越接近真实值，结果也越可靠。

（2）同一药效评价区域应专人调查记载，以减少人为误差，提高精确度。

（3）设立对照组，消除试验中的偶然误差。在田间药效评价中应设对照有空白对照、标准药物对照等。