塔玛亚历山大藻对中国对虾感染鳗弧菌的影响

塔玛亚历山大藻胁迫6天后，经鳗弧菌人工急性感染，注射生理盐水的阴性对照组实验期间累积死亡率为0，其余各实验组均在12 h内大量死亡，其累积死亡率超过整个实验期间累积死亡率的50%，48 h后不再死亡，累积死亡率保持恒定，但两个加藻组在同一时间点的累积死亡率高于海水对照组，且随着藻浓度升高而有升高的趋势。加藻对照组3在第12 h的累积死亡率为40%，显著高于海水对照组（累积死亡率28%）（P , 0.05）。

图25　塔玛亚历山大藻暴露下中国对虾肝胰腺、鳃组织和血淋巴TLR和Relish基因相对表达量注：*表示与海水对照组1相比差异显著（P , 0.05）

图26　塔玛亚历山大藻暴露后对中国对虾经注射感染鳗弧菌后的累积死亡率（%）注：*表示与海水对照组1相比差异显著（P , 0.05）

塔玛亚历山大藻是一种典型的PSP产毒藻，对鱼（颜天等，2002），贝类（Yan et al，2003）具有致毒效应，对虾类也有急性致死作用，谭志军等（2002）研究发现塔玛亚历山大藻（ATHK）对黑褐新糠虾（Neomysis awatschensis）96 h半致死浓度（96 h LC50）为7.0.0　cells/mL，王雪虹等（2007）也研究发现塔玛亚历山大藻（ATDHO1）对南美白对虾（Penaeus vannamei）蚤状幼体的96 h LC50.7.500　cells/mL。本实验所用的塔玛亚历山大藻1.0.0　cells/mL是在塔玛亚历山大藻对中国对虾急性毒性试验的基础上进行设定的，为96 h LC50的1/10，试验中没有出现对虾的死亡。

微藻与虾病的关系，国内外已有研究报道。对虾多种病毒病的暴发与对虾养殖环境中的微藻密切相关（蔡生力等，1995；孙刚等，1999）。本研究中采用投喂方式对中国对虾进行WSSV人工感染，各感染组虽都在第3天检测到阳性结果，第4天发病出现死亡，但在同一时间点的累积死亡率感染加藻组高于未加藻的感染组，且随着藻浓度升高而升高，这表明塔玛亚历山大藻胁迫，降低了对虾抗WSSV感染的能力。

TLR和Relish基因在无脊椎动物抗病力方面的作用，已在研究中得到证实。Wang 等（2012）研究发现凡纳滨对虾在WSSV 感染后，TLR基因表达上调。Toll通路可能通过血细胞内聚合酶链式反应引发其抗病毒免疫机制（Qiu et al，1998）。阎慧等（2008）研究发现注射未灭活 WSSV 病毒能引起中国对虾 Relish 基因的明显上调表达，对虾可通过上调Relish基因的表达，抵御外界病毒的侵染。

本研究中200 cells/mL 塔玛亚历山大藻胁迫72～144 h，中国对虾的肝胰腺、鳃和血淋巴的TLR和Relish 基因表达或被显著抑制，或恢复至海水对照组的水平。而1.0.0　cells/mL藻中对虾鳃组织和血淋巴的上述基因表达在48～144 h被显著抑制，肝胰腺的表达在72～144 h被显著抑制。TLR和Relish基因表达被抑制可能降低了中国对虾抗病毒的免疫防御能力，从而导致了同一时间点的感染加藻组的累积死亡率高于未加藻的感染组。

在无脊椎动物先天性免疫系统中发挥重要作用的抗菌肽主要是通过Toll信号通路和Imd信号通路诱导产生。而多数抗菌肽基因的表达是通过Imd-Relish途径激活的（Uvell et al，2007）。Lindsey等（2012）用疟原虫感染疟蚊研究Imd信号通路的相关因子，通过使Relish过表达后发现抗菌肽大量表达使得疟蚊的抗菌力增强。果蝇的Relish在调节抗菌肽基因的表达方面也起着关键性的作用（Hedengren et al，1999）。细菌注射可诱导疟蚊Relish转录表达上调（Shin et al，2002）。弧菌刺激下中国对虾淋巴器官的Relish基因明显上调表达。因此，Relish基因表达被抑制，可导致机体抗菌能力下降。Han-Ching 等（2010）研究表明凡纳滨对虾TLR基因RNAi被敲除后，凡纳滨对虾的死亡率显著增加而其对哈维弧菌（Vibrio harveyi）的清除率显著降低，表明TLR基因参与抗弧菌的免疫反应。中国对虾注射鳗弧菌后，TLR基因表达显著上调，凡纳滨对虾在受到溶藻弧菌（V.alginolyticus）攻击后，其TLR基因也呈现上调表达。因此，对虾TLR的表达水平一定程度上反映了对虾对入侵病原识别的灵敏性，而对病原识别的灵敏性是评价机体免疫机能的核心内容之一，国内外已经将TLR基因的表达水平作为衡量虾类免疫机能的一项重要分子水平指标。本研究中塔玛亚历山大藻胁迫下，在采样的中后时间点对虾肝胰腺、鳃和血淋巴的TLR和Relish基因表达被抑制，表明塔玛亚历山大藻暴露会影响中国对虾细胞免疫反应中异物入侵信号的传递，降低对虾对入侵病原识别的灵敏性，导致对虾抵御病原微生物的能力下降。不同浓度塔玛亚历山大藻暴露6天后的中国对虾，经鳗弧菌人工急性感染后，两个加藻组在同一取样时间点的累积死亡率高于未加藻的海水对照组，且随着藻浓度升高而有升高的趋势，这表明塔玛亚历山大藻长时间暴露降低了中国对虾抗弧菌能力，其抗菌能力与检测的TLR和Relish基因表达量变化基本相吻合。