等电聚焦测定蛋白质等电点

实验九　等电聚焦测定蛋白质等电点

【实验目的】

1．了解等电聚焦的基本原理。

2．了解等电聚焦的应用。

【实验原理】

等电聚焦(isoelectric focusing，IEF)目前已广泛用于蛋白质分析和制备中，是20世纪60年代后才迅速发展起来的重要技术。IEF的基本原理是，在电泳槽中放入两性电解质，如脂肪族多氨基多羧酸(或磺酸型、羧酸磺酸混合型)，pH值范围有3～10、4～6、5～7、6～8、7～9和8～10等。电泳时，两性电解质形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH值梯度，正极为酸性，负极为碱性。蛋白质分子是在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性pH值梯度中进行电泳。样品可置于正极或负极任何一端。在电场中，蛋白质分子在大于其等电点的pH值环境中以阴离子形式向正极移动，在小于其等电点的pH值环境中以阳离子形式向负极移动。当置于负极端时，因pH＞pI，蛋白质带负电向正极移动。随着pH值的下降，蛋白质负电荷量渐少，移动速度变慢。当蛋白质移动到与其等电点相应pH值位置上时即停止，并聚集形成狭窄区带。

如果在pH值梯度的环境中将含有各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，不管混合蛋白质分子的原始分布如何，都将按照它们各自的等电点大小在pH值梯度中相对应位置聚集，最终使不同等电点的蛋白质分子分隔在不同区域，这种按等电点大小在pH值梯度某一位置进行聚集的行为即是聚焦。聚焦部位的蛋白质质点的净电荷为零，测定聚焦部位的pH值即可知道该蛋白质的等电点。因此，IEF中蛋白质的分离取决于电泳pH值梯度的分布和蛋白质的pI，而与蛋白质分子大小和形状无关。

IEF的优缺点。优点:①分辨率很高，可把pI相差0．01的蛋白质分开。②样品可混入胶中或加在任何位置，在电场中随着电泳的进行区带越来越窄，克服了一般电泳的扩散作用。③电泳结束后，可直接测定蛋白质pI。④分离速度快，蛋白质可保持原有生物活性。缺点:①电泳中应使用无盐样品溶液，否则高压中电流太大而发热。但无盐时有些蛋白质因溶解性能差易发生沉淀，克服方法是在样品中多加些两性电解质。②许多蛋白质在pI附近易沉淀而影响分离效果，可加些脲或非离子去垢剂解决。

两性电解质载体有AmPholine(LKB公司)、Servalyte(Serva公司)、Pharmalyte(Pharmacia公司)及国内产品。两性电解质载体的选择主要依据被测蛋白质的大概等电点范围。

【实验器材】

玻管(Φ0．5 cm×10 cm或Φ0．25 cm×10 cm)、圆盘电泳槽、直流电源、注射器、玻璃平皿、直尺、刀片、两面板、parafilm封口膜、1．5 ml的EP管等。

【药品试剂】

1．40%蔗糖。

2．30%丙烯酰胺。

3．Ampholine两性电解质载体(pH3．5～10)。

4．10%过硫酸铵。

5．TEMED。

6．待测蛋白质溶液(如2 mg/ml的牛血清白蛋白溶液)。

7．20 g/L的NaOH溶液、5%磷酸溶液、12%三氯乙酸溶液。

【实验方法】

1．配胶前准备工作:取2支玻璃管(Φ0．5cm×10cm或Φ0．25cm×10cm)，用Parafilm封口膜(或乳胶橡皮)紧紧与一端管口相贴以保证封闭管口。封端朝下作为管底，垂直放置在制胶管架上，加入40%蔗糖3～4滴。

2．小烧杯内按表3-10所示顺序分别加入试剂，混匀后，将凝胶液加入玻璃管中，直至离玻管顶端1 cm处为止，上面再以2～3滴蒸馏水覆之。注意不要搅动凝胶，保持其表面平整。室温静置进行聚合，当凝胶与水之间出现清晰界面时，表示聚合完成。

表3-10　　　　　　　等电聚焦中凝胶的配置

3．剥去封胶的Parafilm，甩掉玻璃管两端的水和蔗糖液，用少量蒸馏水洗涤两端残留的未聚合聚丙烯酰胺，将玻璃管插入圆盘电泳槽的胶塞孔中。将所有胶塞孔都插满玻管，如果没有多的玻管，用未开孔胶塞封闭样品槽。

4．将样品槽翻转，用注射器吸取少量NaOH溶液，加入玻管内，以排出气泡。

5．向样品槽(圆盘电泳槽上槽)内加入少量5%磷酸溶液，溶液量淹没过胶塞面即可，观察是否漏液。如果漏液，需重新插管。如果不漏液，继续加磷酸溶液，直至淹没过玻管上缘。

6．向圆盘电泳槽下槽加入20 g/L NaOH溶液，液面淹没过玻管下缘即可。

7．放入样品槽，加盖，上槽接正极，下槽接负极，打开直流电源，恒压160 V，聚焦约4小时，当电流接近零时停止电泳。

8．聚焦结束后取出凝胶管，先用蒸馏水洗涤两端，然后用带长针头的注射器吸取水，插入胶柱与玻璃管内壁之间，缓慢旋转玻璃管，边旋转边注水，边推进针头，使凝胶条与管壁剥离，然后用洗耳球对玻璃管一端轻轻加压，使凝胶条从玻璃管内滑出，标明胶条正负端，并对凝胶条编号。

9．测量凝胶条长度L1和L1’并记录。

10．将一根凝胶条(长度为L1)放入培养皿中，加入12%三氯乙酸溶液固定，20分钟～2小时即可见到白色蛋白条带。

11．测量固定后的凝胶条长度L2，以及凝胶条正极端到蛋白质白色沉淀条带中心的距离Lp，并记录。

12．将另一条未经固定的凝胶(长度为L1’)按照从正极端到负极端的顺序用刀片依次切成5 mm长的小段，分别置于有1 ml蒸馏水的试管中浸泡过夜。次日用pH试纸测量溶液pH值，并记录。

13．绘制pH值梯度曲线:以凝胶柱长度为横坐标，pH值为纵坐标作图。由于所测得的每一管之pH值是5 mm长的小段胶条的pH值混合平均值，作图时应把此pH值视为5 mm小段的中心区pH值，即第一小段的pH值所对应的胶条长度应为2．5 mm，其余胶条段的长度依次按(5n～2．5)mm类推。

14．计算蛋白质样品等电点:根据蛋白聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度tLp’，从pH值梯度曲线上查到对应pH值即为该蛋白的等电点(表3-11)。

表3-11　　　　　　　蛋白质样品等电点的计算

L1:凝胶柱固定前长度(mm);

L2:凝胶柱固定后长度(mm);

Lp:固定后蛋白质白色沉淀区带中心距凝胶柱正极端的长度(mm);

tLp:固定前蛋白质聚集部位距凝胶柱正极端的实际长度(mm);

L1’:未固定凝胶长度，即测定pH值那支凝胶的长度(mm);

tLp’:在未固定凝胶中待测蛋白质距凝胶柱正极端的实际长度(mm)。

pI:待测蛋白的等电点。

【注意事项】

1．样品要脱盐，否则区带扭曲;要彻底溶解，未彻底溶解的颗粒易引起拖尾;样品溶液中可加变性剂如尿素(6～8 mol/L)、去污剂等。加样量取决于样品中蛋白质种类及检测方法的灵敏度。一般以0．5～1 mg/ml蛋白质为宜，最适加样体积10～30μl，对不稳定样品可进行预电泳。

2．电极缓冲液应根据两性电解质pH值范围加以选择，可参见相应产品说明书。

3．样品可直接加在胶的顶部，亦可以在胶聚合前加入胶的混合物内一起聚合，须视样品的浓度及稳定性而定。如果样品比较浓，且易失活，一般在电泳前加到胶的顶部。为了不使样品接触电极溶液，在加样品后，再将胶管顶部充满1%两性电解质。样品也可以经预电泳后再加入，这也要看蛋白质样品对pH值的敏感程度。

【思考题】

1．简述等电聚焦法测定蛋白质等电点的原理。

2．简单叙述等电聚焦的应用。