三种测活方法的比较

13．5．1　SOD三种测活方法的比较

13．5．1．1　黄嘌呤氧化酶－细胞色素c法

酶活性单位定义：在一定条件下，3mL的反应液中，每1min抑制氧化型细胞色素c还原率达50%时的酶量定义为一个活性单位或McCord单位。

测定系统为：pH为7．8、300mmol/L的磷酸钾缓冲液0．5mL，其中含0．6mmol/L EDTA；6×10^－5mol/L氧化型细胞色素c溶液0．5mL；0．3mmol/L黄嘌呤溶液0．5mL；1．3mL双蒸水，在25℃下预保温10min，最后加入9．0×10^－5mmol/L的黄嘌呤氧化酶溶液0．2mL，并立即计时。速率变化在2min内有效，并控制黄嘌呤氧化酶浓度，使氧化型细胞色素c还原率在550nm波长处吸光度A值变化为0．025/min。测定SOD活性时，加入SOD待测液0．3mL，双蒸水相应减至1．0mL，并控制SOD浓度，使氧化型的细胞色素c还原率的A值降为0．012　5/min左右。加样表见表13－15。

表13－15　黄嘌呤氧化酶－细胞色素c法加样表

根据公式计算SOD在单位体积中的活性：

式中　V_总∶V_定义体积＝3∶3＝1。

13．5．1．2　连苯三酚自氧化法（简称Marklund法）

酶活性单位定义：在一定条件下，1mL的反应液中，每1min控制连苯三酚在420nm波长处的自氧化速率达50%时酶量定义为一个活性单位或Marklund单位。

测定系统为：pH为8．2、54mmol/L的Tris－HCl缓冲液2．8mL，其中含54mmol/L二甲胂酸钠，1．07mmol/L二乙三胺五乙酸；0．1mL双蒸水（配制于10mmol/L HCl中），使反应总体积保持在3min内有效，控制连苯三酚的量，使其在420nm波长处的自氧化速率的A值变化为0．020/min，测定SOD活性时，加入0．1mL SOD被测液，并控制SOD浓度，使连苯三酚自氧化速率的A值降为0．01/min左右。加样表见表13－16。

表13－16　连苯三酚自氧化法加样表

根据下列公式，计算SOD的活性单位：

式中　V_总∶V_定义体积＝3∶1。

13．5．1．3　微量连苯三酚自氧化法（简称325nm法）

酶活性单位定义：在一定条件下，1mL的反应液中，每1min控制连苯三酚在325nm波长处的自氧化速率达50%时的酶量定义为一个活性单位。

测定系统为：pH为8．2、5mmol/L的Tris－HCl缓冲液2．99mL（其中含1mmol/L EDTA－2Na），在25℃下预保温10min，最后加入50mmol/L的连苯三酚（配于10mmol/L HCl）约10μL，使反应总体积在3mL，开始计时。自氧化速率变化在4min内有效，控制连苯三酚量使其在325nm波长处自氧化速率变化为0．070/min。测定SOD活性时，加入40μL的SOD溶液，缓冲液相应减至2．95mL，并控制SOD浓度，使连苯三酚自氧化的A值变化降为0．035/min左右。加样表见表13－17。

表13－17　微量连苯三酚自氧化法加样表

根据下列公式，计算SOD的单位活性：

式中　V_总∶V_定义体积＝3∶1。

13．5．1．4　结果与讨论

称取各种SOD冻干粉样品，用双蒸水配成一定浓度，在不同时间反复用上述3种方法测SOD活性及相应的蛋白质浓度，并进行统计学处理，实验结果见表13－18。

表13－18　不同SOD活性测定比较

实验表明，一个McCord单位相当于1．6个微量连苯三酚法单位或1．9个Marklund单位，这与原联邦德国Boehrigner Mannheim公司的比值接近。如用国产的黄嘌呤氧化酶、细胞色素c和连苯三酚等进行SOD活性测定，并与进口试剂比较，所测数据相差甚大。故SOD活性测定应尽量选用纯度高、质量好、同一批号的生化试剂，同时要严格控制测定系统的pH和离子强度。在SOD活性测定中，一定要弄清楚SOD准确的活性定义。一个完整的SOD活性定义至少包含下面几个要素：温度、pH、测定波长、吸光度变化率、活性定义体积、比色杯光径长度。其中一些基本要素在活性单位定义上比较明确，而另一些要素则在活性单位定义中用“一定条件下”这样一句话来概括，这就需要仔细分析活性测定的具体操作，因为这些要素的改变或模糊不清，都有可能在活性测定中造成误差。经典的McCord法、经典的Marklund法、微量连苯三酚自氧化法（325nm法）的活性定义要素见表13－19。

表13－19　SOD测活方法要素比较

总之，进行SOD活性测定时一定要注意不同方法之间的异同之处，不能简单地从活性定义概念上去推测活性之间的倍比关系。同时，重复测定特定条件下的SOD活性也很有必要，因为在各种测活条件下受到各种主、客观因素的限制，通常会使SOD活性测定误差在10%左右。