间接凝集技术

二、间接凝集技术

将可溶性抗原（或抗体）吸附于适当大小的颗粒性载体的表面，然后与相应抗体（或抗原）作用，在适宜的电解质存在的条件下，出现特异性凝集现象，称间接凝集或被动凝集。

（一）常用的载体

良好载体应具有以下的基本特点：①在生理盐水或缓冲液中无自凝倾向。②大小均匀。③比重与介质相似，短时间内不能沉淀。④无化学或血清学活性。⑤吸附抗原（或抗体）后，不影响其活性。

载体的种类很多，如聚苯乙烯乳胶、白陶土、活性炭、人和多种动物的红细胞、某些细菌等。目前被广泛应用的是人O型红细胞和绵羊红细胞，尤以后者应用更广，因为其来源方便，且其表面有大量的糖蛋白受体（约1 000个以上），极易吸附某些抗原物质，吸附性能好，且大小均匀一致。

（二）技术类型

1.根据载体的不同，间接凝集技术可分为间接炭凝集、间接乳胶凝集和间接血凝技术等。

2.根据用量和器材的不同间接凝集技术又可分为试管法（全量法）、凹板法（半微量法）和反应板法（微量法）。

3.根据吸附物不同可将其分为正向间接凝集技术（吸附抗原）、反向间接凝集技术（吸附抗体）和间接凝集抑制技术。

（1）正向间接凝集技术　用抗原致敏载体以检测标本中的相应抗体（图6-3）。

图6-3　正向间接凝集技术原理示意

（2）反向间接凝集技术　用特异性抗体致敏载体以检测标本中的相应抗原（图6-4）。

图6-4　反向间接凝集技术原理示意

（3）间接凝集抑制技术　以抗原致敏的颗粒载体及相应的抗体为诊断试剂，检测标本中是否存在与致敏抗原相同的抗原，称为正向间接凝集抑制技术。检测方法为先将标本与抗体试剂作用，然后再加入致敏的载体，若出现凝集现象，说明标本中不存在相同抗原，抗体试剂未被结合，因此仍与载体上的抗原起作用。同理可用抗体致敏的载体及相应的抗原作为诊断试剂，以检测标本中的抗体，此法称反向间接凝集抑制技术（图6-5）。

图6-5　间接凝集抑制技术原理示意

（三）临床常用的间接凝集技术

◆间接血球凝集技术（间接血凝技术）

间接血球凝集技术是根据红细胞表面的吸附作用而建立起来的。将可溶性抗原或抗体吸附于红细胞表面，此时红细胞称为“致敏红细胞”。这种致敏的红细胞与相应的抗血清或抗原相遇可产生凝集现象。

【试剂与器材】

（1）伤寒杆菌O抗原致敏红细胞、伤寒杆菌O₉₀₁免疫兔血清、生理盐水。

（2）试管、吸管、吸球等。

（3）37℃水浴箱。

【操作方法】

（1）小试管9只标记号码后置于试管架上。

（2）于第1管加入生理盐水0.9 mL，其余各管各加入0.5 mL。

（3）吸取已加热灭菌的免疫兔血清0.1 mL加入第1管，吹吸混匀后取0.5 mL注入第2管，同样将第2管的血清与盐水混匀，取0.5mL注入第3管。如此依次稀释直至第8管。自第8管吸出0.5 mL弃去。第9管不加血清作对照。

（4）于每管加入0.5 mL已经致敏的0.5％绵羊红细胞悬液，混匀后放入37℃水浴中2 h后观察结果。

【结果判断】

凡红细胞沉积于管底，集中呈一圆点的为不凝集，即“-”。若红细胞凝集，则凝集物分布于管底周围为阳性结果，根据红细胞凝集的程度判断阳性反应的强弱：

“++++”：红细胞形成片层凝集，均匀布满管底，或边缘皱缩如花边状（与肥达反应一致）。

“+++”：红细胞形成片层凝集，面积略多于“++”情况。

“++”：红细胞形成层凝集，面积较小，边缘较松散。

“+”：红细胞沉积于管底，周围有散在少量凝集。

通常以出现“++”凝集的血清最高稀释度为判定滴度终点。

【注意事项】

（1）严重溶血或严重污染的血清样品不宜检测，以免发生非特异性反应。

（2）每次检测，阴性、阳性和稀释液对照只需各做一份。

【临床应用】

间接凝集技术具有快速、敏感、操作简便、无需特殊的实验设备等优点，因此在临床检验中广为应用。可用于检测病原体的可溶性抗原，也可用于检测各种抗体的蛋白质成分。

◆胶乳凝集技术

胶乳凝集技术是将可溶性抗原或抗体吸附于胶乳颗粒表面，此时颗粒称为“致敏胶乳颗粒”。这种致敏的胶乳颗粒与相应的抗血清或抗原相遇可产生凝集现象。如用乳胶凝集技术检测类风湿因子（RF）。类风湿关节炎是一种自身免疫性疾病，患者可产生自身抗体，即类风湿因子（一种抗变性IgG的抗体，多为IgM类抗体），将变性IgG包被于聚苯乙烯胶乳颗粒上，此致敏胶乳颗粒与待测血清中的RF相遇时，即可发生肉眼可见的凝集。

【试剂与器材】

（1）待检血清、阳性对照血清、阴性对照血清。

（2）类风湿乳胶诊断试剂（吸附有变性IgG的聚苯乙烯胶乳颗粒乳胶颗粒，将IgG经63℃10 min处理，可获得变性的IgG）。

（3）载玻片、毛细滴管等。

【操作方法】

（1）取洁净载玻片一张，用标记笔划分为3格，用毛细滴管分别向3格内加1滴待检血清、阳性对照血清、阴性对照血清。

（2）再分别向3格内加致敏乳胶颗粒1滴，用牙签充分混匀后，摇动载玻片2～3min，观察结果。

【结果判断】

（1）肉眼观察出现凝集为阳性，不出现凝集为阴性。

（2）玻片法为定性实验，也可以用试管法作定量测定。

【注意事项】

（1）试剂应保存在4℃，切勿冻存。使用前应平衡试剂接近室温并摇匀。

（2）日光灯光线不利于观察结果。

【临床应用】

常用于可溶性抗原或抗体的检测。