鼠疫间接血球凝集试验

第二节　鼠疫间接血球凝集试验

鼠疫间接血球凝集试验，是将鼠疫杆菌特异性的荚膜提取物F₁水溶性抗原物质载附红血球方法，当这种血球在适宜的介质中与相应的鼠疫抗体相遇时，抗原与抗体发生凝集的发应便通过血球凝集表现出来（原水溶性F₁抗原与抗体发生的反应是肉眼不可见的）。这种反应被称为鼠疫间接血球凝集反应，进行这种反应的试验就被叫做鼠疫间接血球凝集试验，简称为“间接血凝”或“血凝”试验。国外有人称为“被动血球凝集试验”。由于新鲜血球致敏后只能即时进行试验，不能保存带到现场使用；为此，先将绵羊血球醛化处理后才经单宁酸处理，再把F₁抗原载附于经醛化的单宁酸绵羊血球上。醛化血球常用甲醛和戊二醛；甲醛化致敏血球进行血凝试验时阳性被检血清比戊二醛化致敏血球进行试验的滴度要高1～2个滴度，但非特异性凝集较多，为减少非特异性凝集1975年全国鼠疫血凝会议上决定，统一使用戊二醛化血球进行F₁致敏。

鼠疫血凝试验有较高的特异性和敏感性。试验使用的设备简单，操作方便，可迅速获得试验结果，它是鼠疫血清学重要的诊断方法之一。该试验可作为侦察历史疫区动物的潜在感染，鼠疫自然疫源地动物病流行规律、强度和范围的调查方法；又可用来发现新疫区，监视口岸和国境沿线的疫情及对疑似病人或恢复期病人的追溯诊断；也可作判定疫源地健康化和鼠疫菌苗对人群免疫效果考核的指征。

一、实验材料

1．鼠疫血凝致敏血球　用鼠疫杆菌的特异性F₁抗原致敏经醛化和单宁酸处理的绵羊红血球或新鲜血球制品。前者有10%冻干血球或10%混悬液血球两种制品，贮存于4℃～8℃，一年内使用有效，室温可保存半年。后者制备后需在当天使用。

如发现贮存的致敏血球自凝或效价下降4倍者应停止使用。用前以1%正常兔血清盐水稀释成2．5%血球悬液（即3ml兔血清盐水加10%的血球lml）供试管法使用；稀释成1%血球悬液供微量法使用。被稀释的血球最好当天使用，若要延期使用应加入一定量的防腐剂（叠氮钠的最终浓度达0．1%，甲醛的最终浓度达0．3%），置4℃以上冰箱内保存；如温度过低会结冰，血球出现自凝，此时应停止使用。

2．单宁酸血球　供阴性对照使用。有新鲜单宁酸或醛化单宁酸血球。前者制备后当天有效，后者有10%冻干血球和10%混悬液血球两种制品，其保存、稀释方法及注意事项与致敏血球相同。

3．10%甲醛化正常血球　供被检血清非特异性凝集素的吸收处理。保存、稀释方法及注意事项与上相同。

4．鼠疫F₁冻干抗原　供血凝抑制试验作抑制原用。用前准确称取分装于灭菌中试管内，每支0．5～1mg，管口用胶塞或带有玻璃纸的棉塞塞紧，外用橡皮指套套封扎紧，置冰箱内保存。或以1%正常兔血清配成每毫升含1mg的溶液作为母液，保存于冰箱内一月有效，使用时按所需浓度进行再稀释。一般100μg／ml的抗原量作抑制液。

5．1%正常兔血清盐水　供作稀释液用。所使用的血清不能与参与实验的各种血球发生凝集。当天配制当天使用。

6．滤纸条　按所测滤纸对血液的吸附能力制作所需大小的滤纸条，同时设有1．4×1．5cm²的支持段，供编号和采血时支撑用。

7．器械的准备和处理

（1）玻璃器皿：如属新购，应以2%盐酸处理过夜，以除去游离碱，再行清洗，灭菌（干热或湿热灭菌均可），烤干后备用。每次试验用后放入3%来苏儿溶液中浸泡12～24h，然后用苏打水（或洗衣粉水）刷洗，或浸泡于洗液内12～24h后，用流动清水冲洗晾干后灭菌烘干备用。

（2）有机玻璃微量板：要求洁净、干燥。每次用后放入1%盐酸溶液中浸泡过夜，然后用流水冲去消毒剂，再以流水冲刷每个孔穴至洁净为止。甩去水分，放37℃或室温（孔口向下）晾干备用。严禁放入来苏儿溶液和酒精内处理，更不能高温灭菌，否则会造成有机玻璃微量板变质、变色和变形。

（3）定量滴头：以人用或兽用12号针头切断斜面，用钢锉调整尖端，使每滴液量为0．025ml（每0．5ml 20滴），再套上5厘米长的胶管，用时与1ml刻度灭菌吸管相连接。每次用前应校正滴液量。用后放入3%来苏儿溶液内浸泡12～24h，清洗后湿热消毒，放入37℃温箱内烘干备用。

（4）定量稀释棒：系不锈钢制成。用前校正携带量为每棒头0．025ml，液量不足者应扩大棒头缝距。若滴量过大者应缩小缝距，用前和用后应按五步法处理棒头。即：①先放入3%来苏儿溶液中洗涮，并抛净该液；②放入蒸馏水或软水中洗涮；③再用第二瓶蒸馏水或软水洗涮；④抛净水分，放入95%以上酒精液中脱水；⑤放入乙醚中再次脱水洗涮后插入试管架孔内；让其挥发待用。②、③瓶装液体每进行一批试验应更换一次。

（5）其他物品：如橡皮吸头（1ml、2ml及10ml各若干），试管架，橡胶手套，细线手套，解剖动物用具1～2套，酒精灯，酒精，碘酒，硫柳汞，来苏水，新洁尔灭（或升汞），消毒缸（器皿处理缸，鼠尸处理缸，微量板处理缸，手套处理缸和洗手盆等）及个人防常服装等。

二、被检材料的采集和处理

1．血清　患者自静脉采血；动物自心腔或静脉抽血或股动脉放血。以无菌方法采血后，将血液沿管壁注入灭菌中试管内或平皿内，斜置让其凝固后放入37℃温箱或室温中2h，待血清自然析出后，以无菌技术分离放入另一灭菌容器内，按每毫升血清加入1／500硫柳汞溶液一滴（约0．05ml，血清内最终浓度达万分之一），混匀后严封容器口，或经56℃灭活30min后置冰箱或阴凉处保存待检。

2．滤血片　常用于不能采血分离血清的小型动物和死亡动物（包括磷化锌等毒鼠药物毒死者）的血液采集，也可用于患者的末梢血的收集。采血方法是：于纸条支持段首先编好采样号，用手或镊夹住支持段，让吸血段在开放性伤口，放血处或无菌方法剪开的心腔、肝、脾等切面处吸满血液，然后悬挂于竹签上或置于洁净平皿内阴干。不同编号的滤血片不能互相接触，严防污染和交叉。纸条干后按编号分别夹入纸袋内，置室温或冰箱内保存待检。

检验时，每张滤血片吸血段的血清量，按所吸附的全血量的一半计算。如一张滤纸片的吸血段能吸附全血0．05ml的话，则血清量应为0．025ml。将吸血段纸片剪成6～8小块装入与纸片片号一致的小试管内，然后按血清量的10倍加入1%甲醛化血球悬液（用1%正常兔血清盐水配制）进行浸泡洗脱，用稀释棒柄端（每份检材用一根，防止交叉污染）将纸片完全浸于液体内，静置1h或冰箱内过夜后，放入56℃恒温水浴箱内灭活30min，再用类似稀释棒柄的金属杆挤压干纸片抛去纸渣，经3000r／min～4000r／min离心10min，取上清液待检。

三、血凝试验操作步骤

（一）试管法

1．将注明编号的小试管（1×10cm）5～8管（视实验要求增减）排列一排于试管架上，每份血清一排。

2．向每排的第一管内分别加入1%的正常兔血清盐水0．9ml，第二管至最末一管每管各加入0．5ml。

3．于第一管内分别加入编号相同的被检血清0．1ml，稀释均匀后从该管吸出0．5ml加入第二管内，稀释后再由第二管吸出0．5ml加入第三管内，以此类推逐管倍比稀释至最末一管，由最后一管吸出0．5ml弃于3%来苏儿液中，使每管成为不同的血清浓度，每管液量各为0．5ml。稀释度为：第一管1∶10，第二管1∶20，第三管1∶40……等。

4．于每管内各加入2．5%鼠疫血凝致敏血球悬液一滴（约0．05ml）。震荡试管，充分混匀血球悬液后，放37℃2h或室温过夜观察结果。

5．每批试验应设阴性对照两管。

即：1%正常兔血清盐水0．5ml＋2．5%鼠疫血凝致敏血球悬液一滴。

1%正常兔血清盐水0．5ml＋2．5%单宁酸血球悬液一滴。按上述条件混匀观察。

（原则上一般现场检验室不使用鼠疫阳性血清做对照，避免造成混淆）

（二）微量法

1．以玻璃铅笔于有机玻璃微量血凝板上注明检验号，每份被检液6孔（可按每次试验的要求增减）。

2．用定量滴头向每孔内加入一滴1%正常兔血清盐水。

3．用定量稀释棒头蘸取被检血清（或滤血片上清）放入相应编号的第一孔内，旋转稀释棒头10～15次，使被检液稀释均匀后，从第一孔带出一棒头液体放入第二孔内进行稀释，再从第二孔带出一棒头液体放入第三孔内进行稀释，以此类推稀释至最后一孔，并带出一棒头甩入3%来苏儿液中，使每孔成为不同浓度的被检液，从第一孔向后被稀释成1∶2、1∶4、1∶8……

4．以另一定量滴头向每孔内各加入1%鼠疫血凝致敏血球悬液一滴，震荡使血球充分混匀后放入37℃（或室温）2h后观察结果。被检液又被稀释二倍，故从第一孔向后各孔的最终稀释度为1∶4、1∶8、1∶16等。

5．每批试验应设1%正常兔血清盐水与鼠疫血凝致敏血球和单宁酸血球二孔阴性对照（一般现场仍不使用鼠疫诊断血清做阳性对照）。

（三）试验结果判定

1．血球凝集成致密膜状，并向中央卷折或堆积呈花团状者，判为“＋＋＋＋”。

2．血球凝集成薄膜似帽状布于管（孔）底，边缘不整齐者，判为“＋＋＋”。

3．血球凝集成疏松的膜状或粒状，中央有部分没有凝集的血球堆积，边缘不齐者，判为“＋＋”

4．血球沉积于底部中央，或呈纽扣状，周围有少许微弱的凝集颗粒者，判为“＋”。

5．血球完全不凝集，堆积于底部中央，或呈环状，边缘光滑整齐者，判为“－”。

血凝滴度以血清最高稀释度出现“＋＋”之管（孔）的稀释倍数作为该血清的最终滴度。

判定阳性血清的滴度标准，常随被检血清的动物种类，诊断试剂的敏感性和特异性，试验方法和实验者而异，Hudson（1964）以1∶32判为阳性反应滴度。Cavanu氏（1965）确定1∶24以上为阳性滴度。Katheme氏等（1974）提出微量血凝法检查滤血片的滴度低于1∶32者为阴性，1∶32～1∶64为可疑，1∶64以上定为阳性。Meyer氏等（1965）主张1∶4～1∶8判为有反应，1∶16以上判为阳性。不管怎样，应该以血凝抑制试验阳性的最低稀释度为阳性滴度。即微量法以1∶8～1∶16，试管法以1∶20～1∶40为阳性的最低滴度为宜。

判定疫情的标准也随疫源动物种类的地区而异。据报道，当大沙土鼠和旱獭发生鼠疫流行时，血清的阳性检出率可高达60%～100%。前苏联以阳性率在10%以上，滴度在1∶320以上时，可判为当年流行。张洪翊等认为达乌尔黄鼠动物病流行的血凝滴度在1∶240以上。甘肃省的经验证明，血凝阳性在20%以上时即有动物病流行，当血凝滴度在1∶1280左右时，即可在该地检出鼠疫菌。青海证实阳性率有10%左右，滴度达1∶320以上时为当年有流行。云南在疫调中发现，云南野鼠鼠疫血凝阳性率在2．99%，滴度在1∶160以上就有动物病流行，当滴度达1∶1280以上时，就有检到鼠疫菌的可能。

试管法间接血凝试验结果观察图

试管法血凝、血凝抑制试验操作（二排试验）

四、血凝抑制试验操作步骤

血凝抑制试验是用一定量的已知鼠疫F₁特异性抗原中和被检血清中的鼠疫抗体。若被检血清中含有鼠疫特异性抗体时，当加入每毫升含有100μg的鼠疫F₁特异性抗原，充分混合放37℃温箱中作用15min后，所加入的鼠疫菌特异性抗原就会把被检血清中的鼠疫抗体的大部分或全部中和，这种被中和的血清就大部分或全部丧失了与鼠疫血凝致敏血球发生凝集的能力，其凝集现象就大部分或全部被抑制。出现这种抑制现象就叫做血凝抑制试验阳性，证明被检血清中真正含有鼠疫特异性抗体。反之为阴性，说明是非特异性凝集。所以该项试验是鉴定被检血清的最后根据。

在做血凝抑制试验的同时，常规地应设血凝试验列和单宁酸血球对照列。故又把该试验叫做三排试验，或三排复试，具体操作如下。

（一）试管法

1．血清的吸收。取1份被检血清与4份2．5%甲醛化正常血球悬液混合，室温作用15min，以1500r／min，离心5min，取稀释成1∶5的上清供试。

2．将编号小试管排列在管架上，排管支数按第一次血凝阳性滴度增加数管。每份血清三排，第一排为血凝抑制试验，第二排为血凝试验，第三排为单宁酸血球对照。

3．取吸收后的1∶5被检血清0．75ml，分别加入每排的第一管内各0．25ml。另取0．75ml加入装有0．75ml 1%正常兔血清盐水的中试管内；稀释均匀后，从该中试管内取0．75ml分别加入每排第二管内各0．25ml，在中试管内剩余的0．75ml液体中再加入0．75ml 1%正常兔血清盐水，稀释后取0．75ml分别加入每排第三管内各0．25ml，以此类推，平行倍比稀释至最后一管。将中试管内的剩余液体暂时保存于冰箱或室温直至观察到最终滴度为止。

4．于第一排每管内加入100μg／ml的鼠疫F₁特异性抗原液各0．25ml，第二、三排每管内加入1%正常兔血清盐水各0．25ml。震荡混匀后放37℃温箱中作用15min。

5．于第三排每管内加入2．5%单宁酸血球悬液各一滴（约0．05ml，以下同），第一、二排每管内加入2．5%致敏血球悬球各一滴。震荡混匀后放37℃温箱或室温2h后观察结果。

（二）微量法

1．血清的吸收。以1份被检血清加入1．5份2．5%甲醛化正常血球悬液混匀后置室温吸收15min，离心取被稀释成1∶2．5的上清液供试。

2．在微量板上写明材料号，每份材料三列，检验孔数按第一次血凝试验所出现的血凝滴度向后增加数孔。第一列为血凝抑制试验，第二列为血凝试验，第三列为单宁酸血球对照。

3.用定量滴头向第一列每孔内滴加鼠疫F₁抗原（100μg／ml）液各一滴，换另一滴头向第二、三列每孔内滴加1%正常兔血清盐水各一滴。

4．以三支稀释棒分别蘸取一棒头吸收后的1∶2．5被检血清（或1∶5~1∶10的滤血片上清）放入各列的第一孔内，旋转10～15次进行稀释，分别从第一孔携带一棒头液体加入相应列的第二孔内旋转稀释，再从第二孔内带出一棒头液体到第三孔内旋转稀释，以此类推同法稀释至最后一孔，带出一棒头液体加入3%来苏儿液中。稀释过程中应严防棒头互相接触和列间孔内液体相互污染。

5．以滴头吸管取1%单宁酸正常血球悬液加入第三列各孔中一滴，用另一滴头吸管取1%鼠疫致敏血球悬液加入第一、二列各孔内一滴，震荡混匀后置37℃或室温2h后观察结果。

（三）结果判定标准和方法

1．凝集程度的判定按上述血凝试验标准。

2．血凝抑制试验列发生凝集的管孔数比血凝试验列少两管（孔）以上，而单宁酸血球对照列完全不发生凝集者，判为血凝抑制试验阳性。反之阴性。

3．阳性血清应填写血凝阳性报告表，连同剩余血清严密封存后，送有关上级业务主管单位进行再次复试。特别是首次出现阳性的地区和首次出现血凝阳性的动物更不能忽视复查工作。