复壮及保藏

项目七　菌种的退化、复壮及保藏

一、菌种的退化

菌种在传代过程中，因遗传物质发生变异而使原有的优良性状渐渐消失或变坏，出现长势差、出菇迟、产量不高、质量不好、子实体丛生等现象。这些现象泛称为退化。退化是一个群体概念，即栽培中子实体群体中有少数子实体与亲本不同，不能算退化，只有相当一部分乃至大部分个体的性状都明显变劣，群体生长性能显著下降时，才能视为菌种退化。菌种退化往往是一个渐变的过程，菌种退化只有在发生有害变异的个体在群体中显著增多以至于占据优势时才会显露出来。因此，尽管个体的变异可能是一个瞬时的过程，但菌种呈现退化需要较长的时间。

菌种发生退化的原因如下。

（1）菌种混杂。在菌种继代培养过程中，不同品种间交叉感染，导致不同品种的菌丝体混杂在一起，菌丝生长发生变异，导致原有品种生产性状的改变，常常表现出产量下降、质量变劣等。

（2）发生有害突变。一般来说，一个正常菌株经过多代移植，不会导致遗传性状的改变。但是如果一个菌株的菌丝细胞中发生有害突变，而且突变体能适应外界环境条件，那么随着移植次数的增加，有害突变体在菌丝细胞群中所占的比例会逐渐增大。这样，该菌株的生产性能就会随之恶化，退化现象就逐渐显现出来。

（3）杂交菌株的双亲核比例失调。杂交菌株的菌丝体在转管过程中，受到外界环境、营养条件等改变的影响，其中一个亲本的核发育正常逐渐占据优势而另一亲本的核可能不适应而逐渐减弱，这样导致双核比例的失调，随着扩管代数的增加，核比例失调逐渐扩大，最终导致在栽培中表现出退化现象。

（4）感染病毒。菌种感染病毒后，病毒不仅会随着菌丝体的扩大繁殖而增加，而且会通过带毒孢子传染下一代。当菌种携带一定浓度的病毒粒子时，在栽培中都会表现出明显减产，质量下降等退化现象。

防止菌种退化的措施如下。

（1）要防止菌种的混杂。在菌种转管、进行出菇试验等工作中，均应加强品种隔离，减少品种间的混杂，以保证优良品种在较长时间内能保持足够的稳定。

（2）控制菌种传代次数。菌种传代次数越多，产生变异的概率就越大，因此菌种发生退化的概率就会越大，生产中应严格控制菌种的移接代数。

（3）采用有效的菌种保藏方法保存菌种。菌种保存应是短期、中期和长期三者相结合，根据不同的要求运用不同的保藏方法进行扩培和移接，确保菌种能长期保持该品种的原有优良性状。

（4）创造良好的菌种生长良好营养条件和外界环境。菌种培养基的营养条件应适宜，才能使菌种生长健壮，减少退化现象的发生。营养不足和过于丰富对菌种生长均不利。菌种的生长繁殖受到物理、化学、生物等外界条件的影响，如条件适宜，菌种生长正常，不易退化，否则会引起菌种的退化。比如芳香族化合物能诱发绒毛状菌丝体形成扇形菌落，这种菌丝体在料床上易形成致密的白斑，导致产量下降。

（5）对菌种可能遭受病毒的感染应保持足够的警惕。对有疑问的菌种要及时检验。对于确证已感染病毒，尤其是病毒粒子含量大，菌丝体及子实体性状已受到严重影响的菌种，应及时淘汰。

二、菌种的复壮

食用菌菌种在传代、保藏和长期生产栽培过程中，不可避免地会出现菌种退化现象，主要表现在某些原来的优良性状渐渐变弱或消失，造成遗传的变异，出现长势差、抗性差、出菇不整齐、产量低、品质差等，给生产带来巨大损失。保持菌种的优良性状及生命力强的特性是保证食用菌优质高产的重要条件。为了避免食用菌菌种的退化，必须采取复壮措施。常用的菌种复壮措施如下。

（1）系统选育。在生产中选择具有本品种典型性状的幼嫩子实体进行组织分离，重新获得新的纯菌丝，尽可能地保留原始种，并妥善保藏。

（2）更替繁殖方式。菌种反复进行无性繁殖会造成种性退化，定期通过有性孢子分离和筛选，从中优选出具有该品种典型特征的新菌株，代替原始菌株，可不断地使该品种得到恢复。

（3）菌丝尖端分离。挑取健壮菌丝体的顶端部分，进行转管纯化培养，以保持菌种的纯度，使菌种恢复原来的优良种性和生活力，达到复壮的目的。

（4）更换培养基配方。在菌种的分离保藏和继代培养过程中，不断地更换培养基的配方。长期在同一培养基上继代培养的菌种，生活力可能逐渐下降。将碳源、氮源、碳氮比、维生素、矿物质营养作适当调整，对因营养基质不适而衰退的菌种有一定的复壮作用。最好模拟野生环境下的营养状况，比如用木屑保存香菇、木耳等木腐型菌种，可以增强菌种的生活力，促进良种复壮。

（5）选优去劣。在菌种的分离培养和保藏过程中，密切观察菌丝的生长状况，从中选优去劣，及时淘汰生长异常的菌种。

三、菌种的保藏

菌种保藏的目的是防止优良菌种的变异、退化、死亡以及杂菌污染，确保菌种的纯正，从而使其能长期应用于生产及研究。菌种保藏的主要原理是通过采用低温、干燥、冷冻及缺氧等手段最大限度地降低菌丝体的生理代谢活动，抑制菌丝的生长和繁殖，尽量使其处于休眠状态，以长期保存其生活力。常用的菌种保藏方法有以下几种。

（一）斜面低温保藏法

斜面低温保藏法是最简单、最普通的菌种保藏法，也是最常用的一种菌种保藏方法，几乎适用于所有食用菌菌种。首先将要保藏的目标菌种接种到新鲜斜面培养基上，在适温下培养，待菌丝长满整个试管斜面后，将其放入4℃冰箱保藏。草菇菌种保藏温度应调至10～13℃。斜面低温保藏菌种的培养基一般采用营养丰富的PDA培养基，为了减少培养基水分的蒸发，尽可能地延长菌种保藏时间，在配制培养基的时候可以适当调高琼脂的用量，一般增大到2.5%，同时在培养基中添加0.2%的磷酸二氢钾以中和菌丝代谢过程中产生的有机酸，也可以延长菌种保藏的时间。

斜面低温保藏法适用于菌种的短期保藏，保藏时间一般为3～6个月，临近期限时要及时转管。最好在2～3个月时转管一次，转管时一定要做到无菌操作，防止杂菌污染，一批母种转管的次数不宜太多，防止菌龄老化。保藏的菌种在使用时应提前1～2天从冰箱中取出，经适温培养后活力恢复方能转管移植。

（二）液体石蜡保藏法

液体石蜡保藏法是用矿物油覆盖斜面试管保藏菌种的方法，又称矿物油保藏。液体石蜡能隔断培养基与外界的空气、水分交流，抑制菌丝代谢，延缓细胞衰老，从而延长菌种的寿命，达到保藏目的。首先将待保藏的菌种接种至PDA培养基上，适温培养使其长满试管斜面；然后将液体石蜡装入三角瓶中并加棉塞封口，高压蒸汽灭菌2～3次，待灭菌彻底后将其放入40℃烘箱中烘烤8～10h，使其水分蒸发至石蜡液透明为止。冷却后在无菌操作条件下用无菌吸管将液体石蜡注入待保藏的菌种试管内，注入量以淹过斜面1cm为宜，将试管塞上无菌棉塞，在室温下或4℃冰箱中垂直放置保藏。

液体石蜡保藏法适用于菌种的长期保藏，一般可保藏3年以上，但最好1～2年转接一次，使用矿物油保藏菌种时，不必倒去矿物油，用接种工具从斜面上取一小块菌丝先在无菌水中洗涤，然后移接于斜面培养基上即可。液体石蜡保藏法的缺点是菌种试管必须垂直放置，运输交换不便，长期保藏时棉塞易沾灰污染，可换用无菌橡皮塞，或将棉塞齐管口剪平，再用石蜡封口。

（三）沙土保藏法

沙土保藏法是利用干燥的无菌沙土保藏食用菌孢子的方法。取河沙过筛，除去较大颗粒，然后用10%的盐酸浸泡约3h，除去其中有机物质，倒去盐酸，用水冲洗数次至中性，充分烘干；将干沙与土按约3∶1的比例均匀混合后装于安瓿管或小试管，量以0.5～1cm为宜，加棉塞，高压蒸汽灭菌3次（压力0.15MPa，时间30min），再干热灭菌1～2次（160℃，2～3h），进行无菌检验，合格后使用；用接种工具将孢子接于沙土管中搅拌均匀，将接种后的沙土管置于盛有干燥剂（硅胶、生石灰或氯化钙）的容器内，接上真空泵抽气数小时，至沙土干燥为止，经检测证明无杂菌生长后即可用石蜡封口，低温保藏。此法保藏菌种年限为2～10年。

（四）滤纸片保藏法

滤纸片保藏法是将食用菌的孢子吸附在无菌滤纸上，干燥后进行长期保藏的方法。选择滤纸制备滤纸条，白色孢子用黑色滤纸，其他颜色孢子用白色滤纸。将滤纸剪成长2～3cm、宽0.5cm的滤纸条，平铺于小试管中，高压蒸汽（0.15MPa）灭菌30min；采用整菇插种法收集目标保藏菌种的孢子，并制成孢子悬浮液，用无菌吸管吸取一滴于滤纸上，将小试管放入干燥器中1～2天，使滤纸充分干燥，然后低温保藏。滤纸片保藏菌种时间长，菌种不易老化，制种简便，贮运方便。

（五）液氮超低温保藏法

液氮超低温保藏法采用超低温液氮保藏菌种的方法。首先将目标保藏菌种移接到无菌平板上，然后取10%（体积分数）甘油的蒸馏水溶液0.8mL装入安瓿管，用做保护剂，将安瓿管高压灭菌，冷却备用，将长满无菌平板的目标菌种菌丝体用直径为0.5mm的打孔器在无菌环境打下2～3块，放入安瓿管内，用火焰密封安瓿管管口，检验密封性，密封完好后进行降温，以每分钟1℃的速度缓慢降温，直至－35℃左右，使管内的保护剂和菌丝块冻结，然后置于－196℃液氮中保藏。

液氮超低温保藏法适用于所有菌种的保藏，方法操作简便，保藏期长，被保藏的菌种基本上不发生变异，是目前保藏菌种的最好方法。但其保藏设备比较昂贵，仅供一些科研单位和菌种长期保藏单位使用。

除以上几种保藏方法外，还有真空冷冻干燥保藏法、自然基质保藏法、菌丝球生理盐水保藏法等。

思考题

1.什么叫灭菌、消毒和防腐？它们在食用菌生产过程中有何意义？

2.谷粒种的制作要点是什么？

3.堆制发酵料的原则和方法是什么？

4.假如你是技术员，怎样优化食用菌菌种厂的布局？

5.设计食用菌栽培料配方的主要原则是什么？

6.菌种厂的筹建有哪些原则及要求？

7.规范化菌种厂在布局上，哪些房室为有菌区？哪些房室为高度无菌区和一般无菌区？

8.你认为菌种厂的建场与布局都围绕着哪一个中心点？

9.生产利润与哪些因素有关系？