如何进行转录调控的研究

四、如何进行转录调控的研究

（一）研究真核转录起始的方法

这里主要介绍RNA聚合酶Ⅱ转录起始的几种方法。

相对转录速度测定：1977年Weber等建立了新生链分析法（nascent－chain assay），又称run－on（连续）分析法，用于直接测定某一基因相对转录速度。首先培养细胞的核或者培养细胞经过短时间（约5min）的标记反应，³²P－NTP参入到新生RNA链中，制备具有高放射性标记的转录产物，再与过量的待测基因cDNA杂交，分离杂交产物，分别测定总RNA和待测基因转录产物的放射性，从而得到待测基因的相对转录速度。

转录起点测定：此方法又称为失控法（run－off），原理是将培养细胞短时间暴露于32P－NTP中以标记新生的转录产物，再通过图谱分析测定转录单位的转录起始位点。

（二）研究上游顺式作用元件的方法

1．5′端缺失系列分析法（analysis of5′－deletion series）　常用于测定哺乳动物基因调控区上游的顺式作用元件。方法如下：①将待测基因克隆于质粒载体；②以限制性内切酶切于该基因待测的5′端，使之线性化；③以核酸外切酶水解，由于反应时间长短不同，产生一系列上游调控区缺失情况不同的DNA片段；④在这些DNA片段两端连接人工合成的寡聚核苷酸接头，并以两种限制性内切酶水解。其中已知酶切于质粒载体和待测基因的连接位点，另一种酶的切点在接头内，分离纯化待测基因5′端缺失系列片段；⑤连接携带报告基因（reporter gene）的质粒载体和待测基因5′端缺失系列片段，转化大肠杆菌，分离制备质粒DNA，常用的报告基因有半乳糖苷酶基因（lacZ基因）、氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）和荧光素酶基因（luciferase）；⑥将含有待测基因5′端不同长度缺失片段的质粒分别转染培养细胞，或通过微注射使之进入爪蟾卵母细胞；⑦制备培养细胞的抽提物，分析报告基因表达产物的活性，以检测其活性和不同长度基因上游调控区片段之间的关系。如果某一片段存在可促进报告基因的表达，而缺少则表达下降，那么这一段中就可能含有转录调控序列。构建和分析待测基因5′端缺失序列，可以确定它的上游调控区5′端的边界。

2．接头扫描突变法（linker scanning mutations）　可以找出存在于基因转录起点和调控区5′端边界之间的所有调控元件。步骤如下：①构建一系列重叠的调控区突变体，每个突变体各有1个短序列的核苷酸顺序被打乱（scrambing）；②将这些突变体分别转染培养细胞，或通过微注射使它们进入爪蟾卵母细胞，并分析它们对报告基因表达的影响。

3．DNaseⅠ足迹法（foot printing）　可以测定DNA结合蛋白（包括转录因子）在DNA上的结合位点。基本步骤如下：①利用DNaseⅠ部分水解蛋白－DNA复合物，通过末端标记识别切割位点，原理和DNA测序相同；②回收DNA片段，经过变性再进行凝胶电泳；③放射自显影。在放射自显影图谱中，每个区带的位置对应于一定的碱基数。游离的DNA分子（未结合蛋白因子）的每个敏感键均被DNaseⅠ断裂，但蛋白因子－DNA复合物只有位于非结合位点的部分敏感键断裂，而蛋白因子覆盖的结合位点区敏感键受到保护，不会断裂。本方法的原理与DNA序列分析的基本原理相同，通过此法可得出DNA结合蛋白的覆盖的大小，并确定其DNA序列。

4．硫酸二甲酯法　硫酸二甲酯能使嘌呤甲基化（G的7位甲基化和A的3位甲基化），与DNA结合蛋白紧密接触的嘌呤就不能被甲基化。当DNA结合蛋白（包括转录因子）与DNA的一段序列结合时，其中许多碱基并不是处于紧密结合状态，用DNaseⅠ测得不被甲基化的嘌呤碱基就是与DNA结合蛋白紧密结合的位点，见图2－10。

图2－10　DNaseⅠ法和硫酸二甲酯法的作用示意图

（三）鉴定和纯化转录调控因子的方法

1．电泳迁移率变动分析法（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）　通过顺式作用元件与细胞核抽提物中的相关蛋白之间的特异结合能力，鉴定转录因子的存在。基本原理是：如果转录因子结合于顺式作用元件，则电泳迁移率变慢。因此，利用末端标记的调节序列元件、细胞核抽提物（含转录因子）以及非标记序列的不同组合，通过电泳放射自显影图谱，就可以鉴别转录因子的存在。这5种组合为：①只有标记的调控序列元件，电泳呈一条带；②加入核蛋白抽提物和末端标记的调控序列元件，电泳有两条带，分别是调控序列区带和蛋白因子与调控序列结合的区带；③加入核蛋白抽提物、末端标记的调控序列元件和过量的非标记调控序列片段，由于竞争作用，仅呈现一条带；④加入核蛋白抽提物、末端标记的调控序列元件和不能结合转录因子的过量非标记调控序列突变1，电泳出现2条带；⑤加入核蛋白抽提物、末端标记的调控序列元件和不影响结合转录因子的过量非标记调控序列突变2，电泳为一条带。

2．染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation assay，CHIP）　通过顺式作用元件与细胞核抽提物中的相关反式作用因子之间的特异结合能力，应用反式作用因子的抗体进行免疫共沉淀，从而鉴定转录因子。