动物细胞培养工作的基本要求和工作方法

任务3　动物细胞培养工作的基本要求和工作方法

体外培养的细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是培养成功的先决条件和首要条件。动物细胞培养是一项操作程序比较复杂、需求条件多而严格的实验性工作，即便是在设备完善的实验室，若实验者粗心大意、技术操作不规范，也会导致污染。因此，为在一切操作中尽最大可能地保证无菌，每一项工作都必须做到有条不紊和完全可靠。

一、动物细胞培养的基本要求

1.实验前的准备要求

准备工作的内容包括制订实验计划和操作程序，器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净工作台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试。

实验前必须分门别类地制作操作卡片，如清洗卡、消毒卡、细胞常用液（细胞培养液、平衡盐溶液、消化液）配制卡、牛血清检测分装卡、细胞原代和传代操作卡等。各卡片上应注明实验所需器材的名称、规格、数量、操作要领和实验注意事项等。实验前应按卡片收集、清点所需用品，一并放入超净工作台内，这样可以避免操作时因物品不全而往返拿取所造成的污染。

同时，根据每个实验的要求，准备好瓶管支架、器械消毒盒等。实验器材准备数要大于实验使用数，瓶盖数大于瓶数。这样才能有条不紊地做实验，减少忙乱操作所造成的污染。

2.无菌室和操作间的消毒

无菌操作工作区域应保持清洁和宽敞，必要物品如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其他实验用品用完即应移出，以利于气流的流通。无菌室每周用乳酸蒸气（或过氧乙酸）加紫外线消毒1～2次；每天都要用0.2%新洁尔灭拖洗地面一次（拖布要专用），紫外线照射消毒30～50min。用70%酒精擦拭无菌操作台面，实验前将实验器材以70%酒精擦拭后放入超净工作台内，开启紫外灯照射30～60min以灭菌，并启动超净工作台风扇，运转10min后才可以开始实验操作。实验完毕后，将实验物品拿出工作台，以70%酒精擦拭无菌操作台面。实验操作应在台面的中央无菌区域进行，勿在边缘的非无菌区域操作。

3.无菌操作的要求

（1）勿碰触吸管尖头部或容器瓶口，如触及，须更换器材或灼烧后再使用（如瓶口）。

（2）减少手与器材的接触面，学会手指操作。

（3）一切操作，如打开或封闭瓶口、安装吸管与注射器等，都要在火焰前方进行。瓶口、吸管使用前要经过火焰消毒后使用。不要在打开的容器正上方操作。

（4）容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置于桌面。试剂用后立即封闭瓶口，瓶口长时间敞开会增加落菌机会。

（5）每次操作只处理一株细胞株，即使培养基相同也不共享培养基，以避免混淆或细胞间污染。操作间隔，应让无菌操作台运转10min以上，再进行下一株细胞株的操作。对不同的细胞同时操作时，要专管专用，并要勤换吸管，以防止扩大污染和交叉污染。

（6）瓶口液滴不能倒回瓶内。液滴用干酒精棉球擦拭，再经火焰消毒。

（7）操作时动作要准确敏捷，尽量避免空气流动。

4.实验中的操作要求

着装、洗手与外科临床要求相同。双手用肥皂洗净后，浸泡于消毒液中2min，并用75%酒精擦拭。

细胞培养用液、培养基等从冰箱取出，试剂瓶口和外壁经酒精棉球擦拭后入超净工作台。

超净工作台上的物品应布局合理，污物废液缸、酒精棉球缸在右侧位置，酒精灯在中央位置，试剂瓶在左侧位置。火焰无色或微黄色表示酒精杂质少，酒精燃烧完全，不能使用废酒精或工业酒精，这类酒精燃烧时产生的化学物质易附着到吸管或其他器皿上，带入培养液中会伤害细胞。浸泡在75%酒精中的金属器械用已消毒的镊子取出，经无菌干纱布擦拭后，迅速从火焰上通过（器械不能在火焰上灼烧过长时间），冷却后使用，避免烫伤细胞。

取用细胞培养液、牛血清、酶液的吸管，使用后不能再用火焰消毒，因为吸管中残留的培养液被烧焦炭化，再使用时，会把有害炭化物带入培养液中毒害细胞。操作中手指被污染时，可用酒精棉球擦拭。在实验过程中，不要面向操作台讲话或咳嗽，避免唾沫将微生物带入超净工作台内，污染空气。实验者离开超净工作台时，立即用肘关节关闭侧窗口，避免无菌室内细菌随空气流入净化操作区。

5.实验后的要求

实验完毕，关闭超净工作台风机和电源，将未使用过的器材放入盒内，用过的玻璃器材投入清水中浸泡，用包装纸叠卷、绳束后分类归放。最后，将超净工作台台面用酒精纱布或棉球擦拭，紫外线消毒。

二、动物细胞培养的工作方法

进行细胞培养工作时必须注意一定的方法，主要有以下几点。

（1）由于工作环节多，为保证操作上的一致性，避免造成人为的差异，应对所有操作程序如洗刷、配液、消毒等，制订出统一的规范和要求，在一定时间内保持相对稳定，并要求人人遵守。

（2）各种用液（培养液、胰蛋白酶、Hank′s液、抗生素液等）均应由专人负责配制，并保证做到浓度精确、除菌可靠。所有装制备好的溶液的试剂瓶上都要有标签，注上名称、浓度、消毒与否和制备日期。

（3）一切培养用品都要有固定的存放地点，其中尤为重要的是，培养用品和非培养用品应严格分开，已消毒品与未消毒品应严格分开存放。

（4）工作人员应注意自身安全，须穿实验服、戴手套后才能进行实验。对于来自人类或病毒感染的细胞株应特别小心地操作，并选择适当等级（至少ClassⅡ）的无菌操作台。操作过程中，小心毒性药品如二甲基亚砜等，并避免尖锐物（如针头）的伤害等。

以上一切措施都是为了避免各种杂质混入细胞生存环境、防止微生物感染和细胞污染。所谓细胞污染，是指不同细胞之间因操作不当造成的相互混杂，使细胞群体不纯的现象。

知识拓展

细胞培养减少污染的小细节

许多实验者洗手不规范，用70%酒精喷一下手就去做实验了，这是错误的。事实上，仔细洗手比喷酒精效果更好。正确的方法是用肥皂仔仔细细地洗手，一直洗到手腕，指甲缝也要洗，最好洗两遍，然后用酒精擦拭。另外，不能穿半截袖白大褂去做实验，白大褂袖口要长，最好是袖口扎紧的那种，如果不是，把袖口窝向手臂，裸露的手腕部分也一定要喷酒精。戴上手套后手应避免接触工作台外面，如果不得已接触，应再喷酒精。拿培养瓶和培养液的时候应托住下面，切忌拿瓶颈部位。每天开始实验的时候，超净工作台与实验间应用紫外光照射20 min。有一点要注意的是，超净工作台里面一定要尽量少放东西，放得越多越容易造成污染。尽量避免在操作时说话，尤其是严禁在操作间打闹说笑。

每天观察细胞的状态，发现细胞出现问题（如生长缓慢）应立即扔掉。有些污染（如支原体污染），镜检时是看不到的，但是细胞生长异常。所以如果细胞生长异常，请扔掉，同时由于支原体在空气中的传播，请检查培养液和培养箱是否被污染。

思考题

1.细胞培养实验有哪些基本要求和工作方法？

2.实验人员进入无菌操作间之前，应做哪些准备工作？

3.无菌操作的注意事项有哪些？

4.怎样理解有菌环境和无菌环境？