血清丙氨酸氨基转移酶活性测定

实验六　血清丙氨酸氨基转移酶活性测定

实验目的

（1）掌握血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性测定的原理。

（2）熟悉改良穆氏法测定的条件。

实验原理

血清中的ALT在最适的温度和pH值条件下，作用于ALT基质应用液（丙氨酸和α-酮戊二酸）生成丙酮酸及谷氨酸。

丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中显红棕色。另外，取已知浓度的丙酮酸标准液在同样条件下显色，可用比色法测出ALT催化反应生成的丙酮酸含量，从而算出ALT活性。

本实验采用改良穆氏法测定ALT活性，以1mL血清与足量ALT基质液在37℃条件下保温30min，产生2.55μg丙酮酸称为1个酶单位，1mL血清正常值范围为1～38个酶单位。

实验试剂与实验器材

1.实验试剂

（1）1／15mol／L磷酸盐缓冲液（pH＝7.4）。

（2）0.4mol／L NaOH溶液：取标定的1mol／L NaOH溶液400mL，加蒸馏水至1 000mL，充分混匀。

（3）ALT基质液：

①ALT基质贮存液：称取α-酮戊二酸0.3g及丙氨酸8.9g，先溶解至5 mL 10mol／L的NaOH溶液中，再加浓盐酸4mL，以蒸馏水稀释至100mL，混匀，纠正pH值至7.4，加氯仿0.1mL，用力振摇片刻，放冰箱中可长期保存。

②ALT基质应用液：将上述ALT基质贮存液用1／15mol／L磷酸盐缓冲液（pH＝7.4）稀释10倍，加数滴氯仿，用力振摇后放于冰箱中保存，可使用一周。

（4）丙酮酸标准液：

①丙酮酸标准贮存液（1mL含2 000μg丙酮酸）：准确称取丙酮酸钠0.200g，溶于100mL 1／15mol／L的磷酸盐缓冲液中。

②丙酮酸标准应用液（1mL含100μg丙酮酸）：将上述丙酮酸标准贮存液用1／15mol／L磷酸盐缓冲液稀释20倍即得。

（5）2，4-二硝基苯肼溶液：称取2，4-二硝基苯肼40mg，先溶于10mL 10 mol／L盐酸中，再用蒸馏水稀释至100mL。

2.实验器材

试管、恒温水浴锅、分光光度计等。

操作方法

取试管4支，标明测定管、测定空白管、标准管和标准空白管，按表3-3操作。

表3-3　血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性测定方法

将4支试管中物质混匀，放置5min后，在520nm波长下比色，用标准空白管调节零点，读取各管的吸光度值。

计算ALT的活性：

思考题

检测ALT活性在临床上有什么意义？