分子生物学研究的进展及问题

1．2．4　rh SOD分子生物学研究的进展及问题

迄今，人们已从动物、植物、微生物等各种生物体内分离得到了SOD。其中，从动物血中提取SOD最为经济可行，因为血资源丰富、提取和纯化操作简便，目前我国生产和使用的SOD产品绝大部分是来自动物血的SOD。然而，异种蛋白质作为临床应用的注射用药可能会产生免疫反应和交叉反应。虽然SOD是毒副作用很小的生物大分子物质，但作为抗原，多次注入体内仍可诱发免疫反应，从而降低疗效，甚至可能引发过敏反应，有关动物实验证实了这一点。尽管也可从人血中提取人的SOD（hSOD），但由于原料来源有限且价格昂贵，限制了其实用性。因此，为克服此药物在临床上的缺陷，利用基因工程技术制备重组人SOD已经成为当前研究的主要方向。

1．2．4．1　人的SOD基因的克隆与表达

hCu，Zn－SOD基因在大肠杆菌系统中的表达是最常见的。早在1985年，Hallewell等就从人肝cDNA库中扩增出了hCu，Zn－SOD基因，构建了一系列受tac启动子控制的质粒，在大肠杆菌中得到了不同水平的表达，表达产物占菌体总蛋白的13%。1999年华东理工大学施惠娟等人，分别克隆了hCu，Zn－SOD cDNA和hMn－SOD cDNA，测定了它们的全序列，分别在E．coli系统中得到可溶性表达，表达量达到细胞总蛋白含量的33%和50%，均具有酶活性。

利用酵母进行外源基因的表达能对表达产物进行一些加工修饰，因此利用酵母表达hSOD比较优越。Scandella等将rhCu，Zn－SOD在酿酒酵母中成功表达，并对其发酵、纯化进行了研究，纯度可达99%，回收率为62%。Tomoika等将hMn－SOD基因克隆于含酵母PH05启动子的质粒，可得hMn－SOD 4mg/L。

酵母虽有哺乳动物糖基化合成途径的早期过程，但其表达的N－连接、O－连接糖蛋白有很长的寡甘露糖链，因而有极高的抗原性。于是，人们又考虑用昆虫细胞/杆状病毒系统表达外源蛋白质。Fujii等在杆状病毒/昆虫细胞系统中表达了hCu，Zn－SOD和hMn－SOD，实验表明只有在培养基中有相应的金属离子存在时，表达产物才有生物活性。Wright等人将hMn－SOD基因在昆虫细胞中表达，表达量为15%～25%。

Tibell等报道了hEC－SOD基因在中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）中的表达，他们将人胎盘EC－SOD cDNA克隆到CHO细胞中，成功地向培养基分泌了人重组胞外SOD（rhECSOD），Hansson等构建了袋鼠带乳清酸蛋白基因启动子的质粒和带卵－乳球蛋白基因启动子的质粒，用限制性内切酶切下含启动子和hEC－SOD的片段，微量注射入鼠的胚胎，筛选出了能在乳汁中大量分泌rhEC－SOD的鼠，产物具有与天然的hEC－SOD相似的活性。

1．2．4．2　细菌系统表达产物的活性问题

利用细菌系统进行外源基因克隆和表达虽有其优势，但也存在严重缺陷。细菌结构简单，不能对真核蛋白进行正确的糖基化、乙酰化、磷酸化等加工处理，表达产物往往以没有活性的包含体形式存在，对某些大分子糖蛋白，细菌无法表达。利用细菌系统表达hSOD也存在着这些问题。因为hSOD是金属酶，金属离子辅基直接影响着酶的活性，在通常的培养条件下，利用克隆的SOD基因在细菌中表达不能直接获得活性SOD分子，只能得到非活性的酶蛋白。不过有两种方法可以实现非活性Cu，Zn－SOD酶蛋白向活性Cu，Zn－SOD的转变：一是在诱导培养细胞时，向培养液中加入一定量的Cu^2＋和Zn^2＋，Cu^2＋和Zn^2＋可以透过细胞膜进入细胞内与SOD酶蛋白形成具有酶活性的SOD分子；二是提取并纯化SOD酶蛋白，在特定条件下进行体外重组，从而获得活性的SOD分子。需要指出的是，无论采用哪种方法进行这种转变都必须把握好Cu^2＋和Zn^2＋的浓度和比例，否则会严重影响Cu，Zn－SOD的活性。

1．2．4．3　hSOD的生物工程修饰改造与表达

（1）用基因工程方法增加hSOD的稳定性。rhCu，Zn－SOD的自由Cys残基被其他氨基酸残基取代会影响其热稳定性。在rhCu，Zn－SOD中有两个自由Cys残基，即Cys6和Cys111。当被Ala、Ser残基取代后，其热稳定性就增加。因此，利用蛋白质工程方法的定点突变技术可实现个别氨基酸的取代，从而制造出具有更高热稳定性的酶。Sagai等将人Cu，Zn－SOD第6位Cys变为Ser，无论单突变还是双突变，其SOD的酶活性能等同于甚至高于原酶，且在水溶液或水有机溶液中的稳定性远远高于原酶，可以有效地作为抗炎及其他治疗目的的药物使用。

（2）用基因工程方法制造定向SOD药物。Inoue等报道了一种HB－SOD融合蛋白，即hCu，Zn－SOD及hEC－SOD末端区域的融合基因表达产物。HB－SOD的C端区域可以特异地同血管内皮细胞表面的硫酸肝素结合，阻止肾脏对它的排泄，并可定向在血管内皮细胞表面，有效地清除血管内皮细胞周围的脏器实质细胞在生理和病理条件下产生的超氧阴离子自由基。HB－SOD对冷诱导的脑水肿、角叉菜胶诱导的足水肿、应激诱导的胃黏膜损伤、由缺血再灌流引起的心率失调都有明显的疗效。

为了改善hCu，Zn－SOD的治疗效果，提高其在血液循环中的半衰期和靶向性，Boissinot等设计和表达了一种能与肝素结合的hCu，Zn－SOD。在hCu，Zn－SOD和能与肝素结合的来自蛋白C抑制剂的A＋螺旋之间，通过GlyProGly接头形成一个稳定的双功能蛋白。这种杂合的hCu，Zn－SOD－GlyProGly－A＋蛋白在大肠杆菌中得到了表达并被分泌到周质区，且有正常的hCu，Zn－SOD活性，表达水平达15%，表达产物在小鼠血液中的半衰期提高了一倍。

（3）用基因工程方法延长hCu，Zn－SOD的半衰期。一般体内有活性的hCu，Zn－SOD以二聚体的形式存在，是由两个SOD单体非共价缔结而成的，而Hallewell的带tac启动因子的质粒将SOD基因直接连接，并且具有正常的酶催化活性。他们还构建了带3－磷酸甘油醛脱氢酶启动因子和终止序列的质粒，使两个SOD单体之间通过免疫球蛋白IgAl的绞合部位共价连接，在酵母中得到了表达，表达产物具有与天然SOD同样的活性，而且相对分子质量大于68　000的聚合物的半衰期大大延长，从原先的7min增加到了135min。

（4）利用基因工程方法提高SOD的疗效。Gao等对天然的人胞质Cu，Zn－SOD基因进行了改造。由于天然的人胞质Cu，Zn－SOD在药理学上有不少的缺陷：①其生物半衰期短，仅约6min，且易被肾脏清除；②酶本身带净负电荷使得其不易接近细胞表面或不易在血管及内皮细胞表面达到平衡。在SOD的C端接上来源于EC－SOD C端197～200位的（Pro－Gly－Leu－Trp）4个氨基酸残基，因为EC－SOD就是通过由含正电荷的C端26个氨基酸组成的“尾巴”，结合内皮细胞表面的类肝素硫酸酯蛋白聚糖发挥作用的。然后再陆续接上由8个Gly组成的扭动区域和由6个Arg组成的序列。这样的设计是为了提供一个带正电荷的“尾巴”，使酶能更易接近细胞表面。另外，带正电荷的氨基酸残基能部分中和天然Cu，Zn－SOD分子内部的负电荷。经过这样改造的酶能与肝素－琼脂糖亲和而天然酶则不能。实验表达、纯化后发现，经过改造的SOD的生物化学性质与天然酶没有区别，说明C端的正电荷不干扰原酶的活性和理化性质。用这种酶静脉注射发现，它能抑制由角叉菜胶诱导的足水肿，并抑制脑水肿和治疗肝与心的局部缺血再灌流损伤。

1．2．4．4　怎样解决SOD基因工程中出现的问题

在SOD的基因工程中遇到的问题主要集中在以下几个方面：一是SOD基因的来源问题。尽管现在让任何基因在任何细胞中表达，从技术上来说几乎都没有什么问题。但要将SOD用作治疗药物，从消除抗原性的角度出发，当然以克隆hSOD基因为最好；其实，非人来源SOD经修饰后，也可部分替代hSOD。二是SOD基因的类型问题。从对动物模型和植物模型的初步研究结果来看，因Mn－SOD对H₂O₂不敏感，并且可能与抗衰老有直接的关系，故以选择Mn－SOD较为理想。但目前关于SOD疗效的临床证据主要是由Cu，Zn－SOD得出的，Mn－SOD的疗效如何尚待研究。三是SOD单独应用的效果问题。尽管至今尚无直接的研究结果，但有人仍主张将SOD与其他抗氧化酶合并使用，以取得更好的疗效。

如前所述，仅有SOD一个基因的高效表达而没有其他抗氧化物质的协调作用，不仅达不到清除自由基的预期目标，有时还会适得其反，使细胞损伤加剧。解决这个问题的方法之一，是将CAT基因连同SOD基因一起转移到受体细胞中，实现双表达，以消除SOD催化产生的高浓度的H₂O₂所引起的副作用。但这项工作需要同时转移两个基因并要求同步表达，技术难度太大，必须设法解决这一难题。另外，SOD基因的表达是可以诱导的，其诱导因素主要是各种逆境因子，如低温、干燥、强光及多种天然物质等。因此，利用SOD启动子可以借助其开关进行调控，控制某些特殊蛋白质产物如毒蛋白的表达量。

SOD是抗氧酶，氧化与抗氧化仍是生命活动不可缺少的重要环节，因此深入研究SOD不仅有巨大的理论意义，而且有重要的实用意义。估计在未来10年中，SOD在理论和药用研究方面必将会有重大的突破。