骨骼肌组织工程研究

一、肌原细胞与骨骼肌组织再生

正常情况下，骨骼肌卫星细胞具有一定分裂、增殖能力，卫星细胞的数目不会随时间增加而增加。因为分裂产生的肌原细胞会融合入邻近的肌纤维中，使肌纤维细胞核增加，可达数百个，同时使肌纤维增粗、变长，完成肌纤维的发育。一旦骨骼肌受到损伤，不论损伤形式如何，如冻伤、缺血损伤或某些遗传性肌病导致的病理损伤，骨骼肌的再生过程都是大致相同的。首先受损肌纤维出现不同程度坏死，然后在受累区域出现巨噬细胞清除坏死肌纤维，但保留坏死肌纤维周围的基底膜。同时，卫星细胞会被大量激活，在伤后1周内迅速分裂、增殖，数量达到高峰。之后仍维持一定的分裂能力，但数量却逐渐减少。减少的卫星细胞沿着残留的基底膜在原肌纤维部位，相互融合，成为肌小管。肌小管不断接受新生的肌原细胞，或者与相邻肌小管互相融合而逐渐长大，同时肌小管能合成肌原纤维，这就是幼稚的肌纤维。在局部微环境调节下，幼稚肌纤维逐渐成熟。肌肉再生的启动环节在于卫星细胞被激活，以及激活的卫星细胞能在短时间内迅速大量分裂增殖的能力。Cantini等发现肌组织受伤后的48h，受损区内巨噬细胞数量达到高峰，较卫星细胞大量增殖的峰时（3d）早，认为巨噬细胞能激活卫星细胞。从大鼠无菌性腹膜炎经腹腔灌洗而获得的含大量巨噬细胞的腹腔渗出液加入大鼠肌原细胞原代培养物中，发现巨噬细胞与肌原细胞混合培养能明显提高肌原细胞有丝分裂及分化融合形成肌小管的能力。说明巨噬细胞一方面担负清理坏死肌纤维的功能，另一方面负责分泌一种选择性刺激成肌源性细胞增殖、分化的因子，启动再生形成肌纤维的过程。

受损骨骼肌再生主要取决于三个方面：①基底膜的完整性；②受损肌肉的血供重建；③受损肌肉的神经支配。当受损肌肉肌纤维被巨噬细胞清理后，外周的基底膜能保留下来，就像许多中空、“管道”样的支架。“管道”样的微环境能充分诱导再生肌纤维分化，并沿原先肌纤维的方向排列。在骨骼肌冻伤的动物模型中，受损肌组织的基底膜结构完整，能充分诱导再生过程。在挫裂伤的情况下，基底膜的排列、结构均不可避免地受到损伤，其再生必然是不完全和无序的。

1980年Hansen－Smith和Carlson等研究游离大鼠趾长伸肌原位缝合（无血管吻合）后整块肌肉的再生过程。缝合后第1天，整块肌肉均处于缺血状态，仅在肌肉较表浅处可残留一些肌纤维，大量卫星细胞通过渗透作用，由邻近组织获得营养。在肌肉中心部位，肌纤维坏死，但卫星细胞则因趋化作用迁移到周边部位而存活。第2天有窦状毛细血管由周边正常组织长入，直到第7天，能达到肌肉中心部位。在第1周内，坏死中心逐渐缩小、吸收，再生的组织随着血供的恢复向中心推移。一般在3～5d可见带横纹的再生纤维。第10天，绝大部分肌肉均由再生的较细小肌纤维组成，肌纤维再生已达完全。同时可见神经纤维再生，一般在3～4周后才有神经纤维长入。到60d时，肌梭形成。显然，神经再生滞后于肌纤维再生。大多数情况下，再生肌纤维若得不到良好的神经调控会自发萎缩，由脂肪、成纤维细胞所代替。

二、肌原细胞移植

肌原细胞移植主要用于肌营养不良症的治疗。肌营养不良症（muscular　dystrophy，MD）是一组多见的难治性疾病，多数与遗传因素有关。近20年来，特别是20世纪90年代以来，分子生物学研究的进展，使以 MD为代表的一组肌病在认识和诊断水平方面都有了极大的发展。自1986年Monaco等首次将Duchenne型肌营养不良症（DMD）中抗肌营养不良蛋白（dystrophin）基因定位于Xp21．2之后，目前几乎对所有常见形式的肌营养不良症的基因定位和主要基因产物都了解得较为清楚。

肌原细胞移植（myoblast　transfer　therapy）：自Partridge等用mdx小鼠模型证实肌原细胞移植治疗有效后，Gussoni等进行了DMD基因治疗的临床研究。此后华裔学者罗盖博士发展了肌原细胞的快速培养方法，建立了细胞治疗中心，以成亿计的肌原细胞在患者全身近百点进行多点肌肉植入，得到较为满意的效果，但其远期疗效仍在随访之中。Dystrophin基因缺失被认为是DMD的主要致病原因，因此，将Dystrophin基因通过质粒或病毒（腺病毒、反转录病毒）等载体转入病肌组织中成为研究热点。然而病肌转染Dystrophin基因的表达不高；同时由于病毒作为载体具有较高的抗原性等缺点，限制了其临床应用。近年来，虽然在病毒结构方面进行抗原性的改造，借以达到降低抗原性之目的，然而这个问题至今没有完全解决。Utrophin属于Dystrophin的异构体。在正常组织中，它分布于神经肌肉接头和神经末梢部位，而骨骼肌膜上表达很低；若能使它表达增加，即能抑制Dystrophin的缺陷，阻止病情的发展。因此，增加utrophin基因的表达已作为探索DMD基因治疗的新途径。

肌原细胞在活体内能融入邻近肌纤维中，这是正常肌纤维生长或受损肌纤维再生的基本反应。研究发现，成肌细胞一旦融入肌纤维中就不表达Ⅰ类主要组织相容性复合体（major　histocompatibility　complex　classⅠ，MHC－Ⅰ）抗原。如果提高所移植肌原细胞的融合能力（如纯化所培养的肌原细胞）可减少宿主免疫系统对移植细胞的攻击。Fang等分离出MHC－I抗原阴性的肌原细胞系，他们发现MHC－I抗原阴性的肌原细胞体外增殖与分化能力与MHC－I抗原阳性的肌原细胞无差别。

肌原细胞是哺乳动物体内惟一能大量分裂、增殖及迁移的前体细胞，具有与宿主肌纤维融合的能力，可作为一种有效载体广泛用于目的基因的转移。目前已经通过基因工程获得能表达人类Ⅸ因子（human　factor，Ⅸ，hFⅨ）、红细胞生成素（erythropoietin，EPO）及克隆形成刺激因子（clony　stimulating　factor－1，CSF－1）等基因产物的肌原细胞株。将这些基因工程化的肌原细胞移植到对应疾病的动物模型后，均能在受者的外周血中测得相应的基因产物。

三、骨骼肌组织工程研究

1．肌原细胞培养　骨骼肌组织工程研究的种子细胞是肌原细胞。肌原细胞培养已有较为成熟的技术，最经典的就是按照类似Blau的方法，采用胰蛋白酶与胶原酶混合分步酶消化法分离出肌原细胞。肌原细胞常用的培养基为以F12为基础的培养基，通过添加不同浓度的血清、并辅以缓冲液配置成常规的生长培养基或者融合培养基。

近年来从多个方面研究了肌原细胞培养的条件与技术，较为详细地对影响肌原细胞的增殖与分化的因素开展了研究，尤其是生长因子和激素方面涉及较多。如类胰岛素生长因子－Ⅰ（insulin－like　growth　factorⅠ）对可以防止肌原细胞凋亡，在协同因子的作用下可以促进肌原细胞增殖，但却不是直接的刺激因子。类胰岛素生长因子－Ⅱ（insulinlike　growth　factorⅡ）的作用则在于加强肌原细胞的分化功能。Harper等研究了4种潜在的合成类肽类激素或者生长因子在分化培养基中对肌原细胞蛋白质形成的影响：胰岛素（insulin）与其作为生长调节素的作用一致，仅在高浓度时才有作用；类胰岛素生长因子－Ⅰ在非大鼠的培养原代培养基或L6细胞系的分化培养基中时，在低浓度水平就有活性；微量的表皮生长因子（epidermal　growth factor）在绵羊原代肌原细胞的培养中显示了高的促进合成代谢的能力；牛血清中提取的生长激素对绵羊肌原细胞增长没有影响，然而在L6系大鼠肌原细胞培养时，高浓度的生长激素却显示抑制蛋白质的分解等等。

Kujawa等通过电镜观察及二维SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳发现，如果肌原细胞培养在以透明质酸为底物的培养基中，肌原细胞的融合被抑制，而其大分子的生物合成过程并没有被启动，因此受到融合阻断的肌原细胞继续分化。而当将此肌原细胞转入以胶原为底物的培养基后，肌细胞重新合成其特征性蛋白质并形成多核肌小管。提示透明质酸具有促进肌原细胞增殖、抑制分化的作用，并对肌原细胞融合的抑制不是永久性的，不同于其他的抑制融合和生成肌纤维的过程。

掌握影响体外培养肌原细胞增殖和分化的因素是研究肌原细胞在机体内各项行为的基础，为寻找合适的肌原细胞移植载体提供线索，因此也是寻找提高移植效率途径的基础。

2．如何提高肌原细胞移植的效率　组织工程培养肌原细胞的目的是在于用工程化的细胞来修复受损组织，并达到改善组织功能的要求。但肌原细胞移植实验开展以来，无论是对遗传性肌病还是肌组织的严重损伤，其修复效率并不令人满意。虽然有充分的证据证明移植的肌原细胞存活并融入受体组织，但对受体功能的改善还远没有达到让人满意的程度。涉及肌原细胞移植过程的各个方面的改进都将影响到移植效率的提高，并进一步影响到受体功能的改善，所以从更深层次上来说，它关系到肌原细胞移植或细胞介导的基因治疗的前景。

（1）肌原细胞悬液浓度：研究发现，简单地提高细胞移植的浓度并不能无限制的增加植入的肌原细胞与宿主肌纤维的融合，肌原细胞悬液在5×104～2×105个／5μl时，肌原细胞数与宿主细胞融合率成正相关，再提高肌原细胞浓度，其融合率并不增加。

（2）多点注射肌原细胞：肌原细胞缺乏移动性，这也被许多研究所证实。研究发现损伤并不诱导注入的肌原细胞的迁移，而在DMD患者中，肌纤维间密集的纤维和脂肪组织的沉积抑制了肌前体细胞的移动，从而影响了成肌的效率。为了克服此问题，大多数研究者都采用了多点注射肌原细胞悬液的方法。然而，肌原细胞移植的注射点增加有限，对肌原细胞的分布范围的改善作用仍然不令人满意。

（3）肌原细胞移植前受体的准备：肌原细胞移植进入受体组织内，其存留、增殖、分化并与宿主细胞融合为杂合肌纤维，整个过程不仅与移植细胞的活性有关，还与移植受体的全身或局部的状态有密切的关系。面对不同的情况，有针对性地改善机体全身或局部组织条件，将有利于细胞移植效率的提高。

例如为了提高植入的肌原细胞的移动性，虎蛇毒素曾被用来预处理受体肌肉，虽然此方法提高了肌原细胞的移植效率，但虎蛇毒素具有造肌原红蛋白尿，乃至肾功能不全的危险，临床可行性较差。Torrente等也研究了虎蛇毒素及金属蛋白酶（metalloproteinases，MMPS）等预处理受体肌肉的作用：通过利用β－半乳糖苷酶标记移植的肌原细胞，并使用免疫抑制剂FK506排除免疫应答的干扰，发现在提高肌原细胞迁移性方面，胶原酶、基质溶解因子和虎蛇毒素的混合物比胶原酶和基质溶解因子的混合物更有效，而虎蛇毒素的效率最低。Torrente同时发现，MMPS明显有利于肌原细胞的迁移。

（4）移植肌原细胞的准备：许多研究者尝试利用生长因子的刺激来提高肌原细胞移植效率。如Kinoshita等在肌原细胞移植前2d，将碱性成纤维细胞生长因子（basic　fibroblast　growth　factor，bFGF）100ng／ml加入培养基中，发现培养基中的单核的肌原细胞数增加34%，而肌小管的形成却减少。随后，在使用FK506免疫抑制剂的条件下，将β－半乳糖苷酶标记的肌原细胞植入没有做预处理的肌肉中，3d后移植细胞的存留数在实验组和对照组没有显示出差别，而4周后发现实验组的β－半乳糖苷酶阳性肌纤维数明显多于没有用bFGF组（超过4倍）。Ito等采用类似的方法，将半刀豆球蛋白A20μg／ml在移植前2d加入肌原细胞培养基，然后植入没有做预处理的同种异体的肌组织，移植4d后，发现实验组肌原细胞迁移的范围是对照组的3倍多。这些实验为提高人类肌原细胞移植效率作了有意义的探索。

3．支架材料的选择　从组织结构上看，骨骼肌组织由大量成束的肌纤维细胞组成，在电镜下可以看到与其细胞紧贴的是基膜（basement　membrane），其主要的化学成分为Ⅳ型胶原。正常情况时基膜满布毛细血管，营养并支持肌纤维，然而在受伤时，基膜又是肌细胞再生的“地图”，能诱导肌纤维再生。只要基膜没有受到损伤，比如在冻伤的情况下，肌组织就能再生性修复，完全恢复肌肉的结构与功能。在原先完整基膜的诱导下，大量毛细血管沿基膜生长，形成新的基膜，再生的基膜可以被新基膜替代，也可以与新基膜并存。因此可以认为，基膜在再生时可以作为微骨架或支架，引导肌细胞再生。那么基膜作为一种天然支架材料，能与机体相容，能诱导并引导再生，能逐渐被分解、替代，因此这是一个优良的支架材料。然而，在应用上，基膜或Ⅳ型胶原的获取相当困难，如果寻找其类似物，Ⅰ型胶原凝胶是较理想的支架材料之一。

Ⅰ型胶原本身具有促进肌原细胞贴壁、促进细胞分化、提高肌原细胞的融合率等功能。将肌原细胞混合于Ⅰ型胶原溶液中，在37℃孵箱内形成含活肌原细胞的胶原凝胶，如果在从液态到固态的过程中，使其按需要铸型，在特定的力学环境下，可塑形为管状、螺纹管状及片状等，成为人体管型组织工程研究的含活的肌原细胞的支架，可用于多种管型组织工程组织的研究，如组织工程化血管、肠管及食管等。但Ⅰ型胶原在植入受体后，如果不及时降解，也会给再生肌组织的功能带来负面的影响。因此，近年来许多学者在积极的寻找新型材料，使植入的肌原细胞能在受体内更好地生长、繁殖、分化、成熟，更好地行使其功能。

Li　RH等在应用转基因的肌原细胞移植治疗神经退化性疾病的实验中发现，用胶原将聚乙烯对苯二酸酯（polyethylene terephthalate，PET）涂层包裹的纱线作为支架材料比单纯用胶原为支架材料的效果更好：与支架材料复合后的肌原细胞在体外培养的条件下，分别测其生存能力、形态、神经营养因子（ciliary　neurotrophic　factor，CNTF）的分泌情况，发现用PET作为支架材料的复合体产生比以胶原为支架材料的复合体多8倍的活性细胞、而CNTF的分泌量是后者的4倍。

4．移植免疫问题　临床上应用和研究较多的是同种异体移植（allograft）问题，克服其免疫排斥反应常规的方法仍是使用免疫抑制剂。研究证明，许多临床常用的免疫抑制剂如环磷酰胺、环孢素A等都对抑制肌原细胞移植引起的免疫应答无效或效果甚微，在小鼠与灵长类动物中FK506是有效的免疫抑制剂，Skuk等在灵长类的动物实验中发现肌原细胞移植时使用FK506可使移植的细胞存活1年以上，而撤销FK506后，移植细胞即被排斥。Smythe等的研究却表明消耗T细胞比使用FK506更有效，并且，无论在组织相容性或不相容性的宿主中均明显增加肌原细胞迁移的范围，研究认为它可以成为肌原细胞移植的长期辅助方法。而在选用狗的实验中显示无论自体移植还是同种异体移植，当不使用免疫抑制剂时，CD4＋和CD8＋淋巴细胞2周内就开始渗透，标志细胞免疫的出现；单独使用FK506仅抑制抗体的产生，标记的移植细胞存留仍不理想，当联合使用FK506、环孢素A时，显示良好的移植效率。

白细胞介素12的p40亚单位（p40subunit　of　interleukin　12，IL－12p40）基因转染产物因抑制了辅助性T细胞介导的免疫反应，所以IL－12p40的基因转染也是抑制对同种异体和基因改良细胞免疫排斥的有力手段。而单克隆抗体的应用也是较为有前途的疗法，如应用OKT单克隆抗体处理受者，也有人用抗T细胞抗原受体独特型的单抗来防治排斥反应，这些在动物实验中已获一定效果，临床上正在进一步研究。Schneider等用表达CTLA4－lg的转基因肌原细胞联合使用暂时的抗－CD154抗体，明显提高了同种异体移植的存活时间。Guerette研究了结合淋巴细胞表面的单克隆抗体和重组体分子CTLA4－lg用于主要组织相容性抗原不相容的个体之间的移植，当联合使用抗CD4＋、抗CD8＋以及抗淋巴细胞功能相关抗原和CTLA4－lg时比单独使用CTLA4－lg处理移植效率明显更高，但长期效果仍然较差。Pavlath等短期使用环孢素A联合细胞内黏附分子－1及白细胞功能相关分子－1的单克隆抗体亦使移植的同种异体肌原细胞在较长时期内不被排斥。

当然，要彻底消除移植免疫，应尽量使用自体的细胞移植。对于遗传性肌病，可以在自体肌组织中取得肌原细胞并扩增后，用基因转染的方法，将正常的基因导入其细胞的DNA中，再将细胞回植入机体肌组织，当细胞与注射部位的肌细胞融合后，正常的基因表达正常的产物，从而起到治疗原有疾病的目的。Moisset等采用利用带CMV启动子的腺病毒多重转染，驱动6．3kb的人类抗肌萎缩基因cDNA，并在体外测试其基因表达。在这些细胞的培养中，可以检测出抗肌萎缩基因mRNA表达，其值与腺病毒转染率成比例。当用转染有人类抗肌萎缩基因（dystrophin）的mdx鼠的肌原细胞（同时用β－半乳糖苷酶标记）再植入肌组织，在移植后10、 24d时，大量的标记肌细胞表达人类抗肌萎缩基因。同时，人类抗肌萎缩mRNA也利用RT－PCR技术检测到。进一步的研究发现，在DMD中，其自身肌原细胞培养存在严重的增殖能力不足的问题。Huard等则将成肌类基因转染到成纤维细胞中，即用反转录编码得到的MyoD1cDNA导入TnI　LacZ鼠的真皮层成纤维细胞使之转化为类肌原细胞，增殖后用于移植。体内、体外实验均发现转染后的细胞能与其肌细胞融合，也能表达抗肌萎缩蛋白、肌纤维蛋白和β－半乳糖苷酶，移植30d后β－半乳糖苷酶阳性点仍明显可见。