基因重复序列

二、人类基因组

人类基因组包括核基因组和线粒体基因组。

线粒体基因组的序列（又称剑桥序列）共含16569个碱基对（bp），为一条双链环状的DNA分子。双链中一为重链（H），一为轻链（L）。重链和轻链上的编码物各不相同，人类线粒体基因组共编码了37个基因。重链上编码了12SrRNA（小rRNA）、16SrRNA（大rRNA）、NADH－CoQ氧化还原酶1（NADH－CoQ oxidoreductase1，ND1）、ND2、ND3、ND4L、ND4、ND5、细胞色素C氧化酶1（cytochrome CoxidaseⅠ，COXⅠ）、COXⅡ、COXⅢ、细胞色素b的亚基、ATP合酶的第6亚单位和第8亚单位（A6、A8）及14个tRNA等；轻链上编码了ND6及8个tRNA。

一般概念上的基因组是指核基因组，约含3．2×10⁹bp的DNA分子。人类基因的平均长度为27kb，其中编码序列的平均长度为1～1．5kb。根据目前的估算，人类基因的总数只不过20000个，这个数字在基因识别技术改进后可能还会有变化。因此基因及其相关序列仅占总基因组一小部分。其余的DNA序列包括基因之间的间隔序列、重复序列等。目前，对它们的功能知之甚少，已有的研究表明其中一些序列有着特殊的生理意义，包括：调节基因的表达，增强同源染色体之间的配对和重组，维持染色体结构，调节前mRNA的加工以及参与DNA的复制等。

（一）人类功能基因的组织与分布

人类基因组中存在“绿地”和大片“荒漠”。在染色体上有基因成簇密集分布的区域，也有大片的区域只有“无用DNA”（不包含或含有极少基因的成分）。基因组上大约有1／4的区域没有基因的片段（图1－3）。不同基因在基因组中的拷贝数也有很大的差异，这主要是进化过程中细胞对特定基因产物需求的不同造成的。根据基因组中的功能序列的拷贝数及分布特点，将其分为4大类，即单一基因、基因家族、串联重复基因和已失去功能的假基因。

图1－3　人类基因组的组织结构

1．单一基　因在人的基因中，25％～50％的蛋白质基因在单倍体基因组中只有1份或少数几份，故又称为单一基因（solitary gene）或单一序列（unique sequence）。

2．基因家族　从动物细胞中已克隆出的许多基因中发现，它们有的是重复的多拷贝，但不同拷贝之间还略有差异，这一部分基因属于2个或更多个相似基因的家族。在脊椎动物中，这类成倍基因（duplicated gene）构成编码蛋白质基因约一半。它们编码的蛋白质相似，但其氨基酸序列不完全相同，称之为基因家族（gene family），类同的蛋白质组成蛋白质家族（pro－tein family），其蛋白质成员由数个到数十个，个别的可达数百。β珠蛋白基因家族包括5个功能基因：β、δ、Aγ、Gγ和ε，它们分别在生活史的不同阶段表达，各具有不同的功能作用。细胞骨架蛋白、肌动蛋白、管蛋白、中间纤丝等也形成不同的蛋白质家族，可能对同一个体的不同的细胞类型呈现差别性表达，以合理搭配，发挥其生理作用。基因的成倍性、趋异性对进化是有益的，它可以扩大和发展基因的特定功能。成倍基因的产生机制，可能是在减数分裂时重复DM序列之间发生不等交换的缘故。

3．假基因　在人的β珠蛋白基因家族中至少有两个区的序列ψβ1和ψβ2与有功能的β珠蛋白基因相似，但是它没有相应的蛋白质产生，所以叫做假基因（pseudogene）。其他许多基因家族如HLA、snRNA、免疫球蛋白基因家族等都发现有额外的、近似的基因拷贝存在。拟基因是一种畸变基因，即核苷酸序列同有功能的正常基因有很大的同源性，但由于突变、缺失或插入以致不能表达，所以也就没有功能。

4．串联重复基因（tandemly repeated genes）　45SrRNA、5SrRNA、各种tRNA基因以及蛋白质家族中的组蛋白基因是呈串联重复排列的，这类基因叫做串联重复基因。它们不同于成倍基因，编码了同一种或近乎同一种的RNA或蛋白质，rRNA、tRNA基因的每个拷贝完全或几乎完全相同，但是在基因间由间隔DNA（linker DNA）分隔，组蛋白基因家族较复杂，而每种组蛋白基因的拷贝也完全相同。

串联重复基因的存在是符合细胞的需要的。以HeLa细胞的前体rRNA合成为例，细胞每个世代需要500万～1000万个核糖体，需要100个前体rRNA基因才能使细胞每24小时分裂一次。在果蝇的胀泡突变体中，当rRNA基因少于50个时，就是致死性突变。5SrRNA基因量也是很大的，人有2000个，蛙有2000个，tRNA基因量在10～100个之间。组蛋白是真核细胞特大含量的蛋白质，几乎与核内DNA等量，每一种组蛋白至少占细胞全部蛋白质的0．5％～1．0％。而且组蛋白mRNA的寿命短。在细胞周期的1／3时间是DNA合成期，在DNA合成的同时进行着组蛋白合成，所以存在于多细胞生物体细胞的组蛋白重复基因有50～500个之多。

（二）基因组内非基因序列的结构特点

基因组中的非基因序列的研究较少，对其功能也知之不多，但有一点可以肯定，它们并不都是原来认为的“无用”DNA。这些DNA中存在着大量不同形式的重复序列，重复多拷贝序列有的较短，有的较长，可分布于整个基因组，这些重复DNA是通过变性复性实验而被发现的，重复DNA复性较非重复DNA快，而根据复性的速度，又可分为高度重复DNA和中度重复DNA。这里主要介绍这些重复序列的特点。

1．高度重复序列　高度重复序列包括：①反向重复序列由两个相同序列的互补拷贝在同一DNA链上反向排列而成。变性后再复性时，同一条链内的互补的拷贝可以形成链内碱基配对，形成发夹式或“＋”字形结构。倒位重复（reverse duplication）（即两个互补拷贝）间可有一到几个核苷酸的间隔，也可以没有间隔。没有间隔的又称回文（palindrome）结构，这种结构约占所有倒位重复的1／3。倒位重复的单位约长300bp，它们多数散布非群集于基因组中。②卫星DNA（satellite DNA）是另一类高度重复序列，这类重复序列的重复单位一般由2～10bp组成，成串排列，重复次数可＞10⁶。由于这类序列的碱基组成不同于其他部分，可用等密度梯度离心法将其与主体DNA分开，因而称为卫星DNA或随体DNA。按照它们的浮力密度不同，人的卫星DNA可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4种。通过原位分子杂交可知，它们中的大多数位于染色体的着丝粒，果蝇中也发现它可位于染色体的臂和端粒区，而进一步分析表明它是位于染色体的异染色质区。另外还有一种位于染色体着丝粒附近的高度重复序列，重复单位为172bp，这种序列大部分由交替变化的嘌呤和嘧啶组成，有人把这类称为α卫星DNA。卫星DNA可能与染色体减数分裂时染色体配对有关，即同源染色体之间的联会可能依赖于具有染色体专一性的特定卫星DNA序列。③小卫星DNA（minisatellite DNA）由15～100个寡核苷酸组成的重复单位（常富含GC），重复20～50次形成的1～5kb的短DNA，又称为VNTR（variable number of tandem repeats），比上述的卫星DNA（10⁵bp）短。④微卫星DNA（microsatellite DNA）的重复序列为6bp～1kb，如（A）n／（T）n、（CA）n／（TG）n、（CT）n／（AG）n等。由于这些微卫星DNA区域在人类基因组中出现的数目和频率不同，而表现为多态性，因而为人类遗传分析提供了大量的多态遗传标志。由于个体间小卫星DNA及微卫星DNA长度的变化，可用分子杂交方法，以少量的小卫星DNA或微卫星DNA探针即可检测DNA个体差异（两人相同的可能性为9．5×10^－22），是一种新的DNA指纹方法。这种新的DNA标记系统，其多态信息量大于RFLP，可用于基因定位、群体进化、基因诊断等研究。近年来在脆性X综合征、脊髓小脑性共济失调和Huntington舞蹈症等疾病中发现微卫星DNA如（CAG）n、（CTG）n等的不稳定性，往往发生核苷酸三体重复扩增突变（trip1et repeat amplification mutation）。

2．中度重复DNA和可动DNA　中度重复DNA（intermediate repeat DNA）是以不同的量分散地分布于整个基因组的不同部位，可占整个基因组的10％以上。这些间隔的DNA长度可短至150～300bp（short interspersed elements，SINES），也可长5000～6000bp（long interspersed elements，LINES），重复次数在10²～10⁵之间，如果从序列的重复次数来看，rRNA基因、tRNA基因、组蛋白基因等也属于中度重复序列。

在研究中度重复DNA过程中了解到，它们在量上和染色体位置上存在着广泛的变化，被称为可动DNA因子（mobile DNA elements）。从对酵母菌一直到人类的可动因子研究中，发现了一类重复DNA，叫反转录子（retroposon，retrotransposon），它们由DNA转录的RNA为中间物，再通过反转录酶的作用，从RNA→DNA，合成的DNA又重新整合到基因组。

可动DNA因子为什么在基因组中大量存在？它们对生物体有无功能？是否只是单纯的无功能的分子寄生物（有人称之为“自在DNA”，selfish DNA），杂乱地堆放在基因组中，还是在进化中有一定的作用，在基因组结构动态变化中发挥关键性影响？虽然它们中大多数在生物体生活史中无有用的功能，但它们可能影响进化。现在认为基因组的流动性有利于遗传多样性，它们在基因组中位置和含量的变化可以作为进化种子，发生内含子、增强子等新的重组（外显子穿梭，exon shuffling），衍生新的基因或基因结构域、调节区，以促进最优组合。原核细胞无反转录子，一般无内含子，其RNA降解快，限制了新基因的出现，而昆虫、哺乳类的进化优势可能与含大量反转录子有关。新近研究表明，一些中度重复序列还可能具有转录调节作用并参与了hnRNA的加工与成熟。

SINES、LINES是哺乳类基因组中最丰富的中度重复DNA，人类LINES长6～7kb，SINES长300bp，人类基因组中最常见的是L1家族，有50000个拷贝，占基因组的5％，L1可动性的证据是近年来分析两个都患有X染色体突变遗传病的男患者：一个患有血友病，一个患有Duchen－ne肌营养不良，第Ⅷ凝血因子基因和dystrophin基因的克隆和序列分析证明，基因突变不是来自母亲的X染色体，而是L1的插入而引起的。另一类人类SINES是Alu家族（Alurepetitive se－quence，由于有内切酶AluⅠ识别切点），长为5kb，基因组约有500000个拷贝，也占基因组的5％，还发现有10bp短的类Alu序列（Alu－equivalent family）分散在基因和内含子之间。神经母细胞纤维瘤是由于NF1抑癌基因突变，一患者中发现2个NF1等位基因之一有一新的Alu序列，使NF1基因失活，当另一个NF1基因发生突变，进而造成肿瘤的发生。某些隐性遗传病也被发现是由于Alu序列插入到外显子中，致使蛋白编码区遭受毁损。除以上之外，还发现有一些小分子RNA以及一些无功能mRNA，通过反转录插入到基因组DNA中去。