禽流感免疫抗体检测试验操作应注意的问题

杨 芳

（保山市动物疫病预防控制中心，云南保山678000）

摘 要：免疫效果检测的目的是为防疫提供科学依据，要求检测结果必须准确无误，为准确检测禽流感疫苗免疫效果，结合工作实际，从器材准备、试剂配制和规范操作等方面对禽流感血凝 （HA）和血凝抑制试验 （HI）关键环节易出现的问题进行了分析归纳，并提出了该试验关键环节的操作要领和注意事项，为规范试验操作、提高试验结果的准确性提供了参考。

关键词：禽流感；免疫抗体；血凝试验；血凝抑制试验；操作

禽流感是由A型流感病毒引起的一种禽类传染病。根据禽流感病毒致病性和毒力的不同，分为高致病性禽流感、低致病性禽流感和无致病性禽流感。高致病性禽流感一旦发生，易造成大规模流行发病，对养禽业造成毁灭性打击，世界动物卫生组织将其列为必须报告的动物传染病，我国将其列为一类动物传染病。疫苗免疫是预防和控制禽流感发生的最有效措施，评价免疫效果的手段之一是检测免疫抗体的有无和抗体效价的高低。《高致病性禽流感防治技术规范》规定血凝 （HA）和血凝抑制试验 （HI）为目前检测禽流感免疫抗体的法定试验方法，检测结果的准确性直接影响着禽流感免疫效果评价的准确性，因此规范操作尤为重要。笔者结合工作实践经验，从器材准备、试剂配制和规范操作等方面对禽流感血凝 （HA）和血凝抑制 （HI）试验关键环节易出现的问题进行分析归纳，并提出该试验关键环节的操作要领和注意事项，以期为规范试验操作、提高试验结果的准确性提供参考。

1 保山市禽流感抗体检测情况

近年来，禽流感对家禽业的危害日趋严重，省级兽医部门下达的禽流感监测任务量也逐年增加。笔者从2010年开始参与市级兽医实验室对隆阳、施甸、昌宁3个县区的禽流感免疫抗体检测，2010年检测1836份，合格1091份，合格率59.42％；2011年检测1634份，其中H5、H9各817份，抗体合格分别为696份、512份，合格率分别为85.19％、51.82％；2012年检测2242份，其中H5、H9亚型各1121份，抗体合格分别为646份、656份，合格率分别为57.63％、58.52％；2013年检测2052份，其中H5、H9亚型各1026份，抗体合格分别为453份、824份，合格率分别为44.15％、80.31％。从以上数据可以看出，由于保山市近几年对禽流感防控工作的重视，禽流感的防疫密度和质量得到了进一步的提高，但散养户的家禽一般只进行过一次疫苗免疫，少数养禽大户也不按免疫程序进行免疫，因此导致保山市每年禽流感抗体检测合格率参差不齐。为确保不发生区域性禽流感疫情，农业部把禽流感列为国家强制免疫病种，要求群体免疫密度必须常年保持在90％以上，免疫抗体合格率70％以上，但检测结果往往达不到国家的要求，既有免疫密度不高的原因也有实验检测操作的原因。因而作为市级兽医实验室，要为全市禽流感防控提供技术支持，就必须严格按照技术规范和标准，控制试验条件，确保免疫效果检测结果的准确性。

2 禽流感免疫效果检测的试验方法和原理

禽流感血凝 （HA）和血凝抑制 （HI）试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的试验方法，其原理就是禽流感病毒能够与鸡红细胞发生凝集现象，这种红细胞凝集现象可被特异性免疫血清所抑制，即红细胞凝集抑制试验 （HI）。实验室检测人员掌握试验原理是进行试验操作的第一步，也是重要一步，要知其然更要知其所以然。该试验的关键是红细胞试验鸡的选择和红细胞的洗涤配制，以及效价测定和四单位抗原的配制。

3 HA和HI试验关键环节操作要领和注意事项

3.1 器材的准备

3.1.1 玻璃仪器

为防止外来细菌对试验的污染，采血和制备红细胞使用的所有仪器 （包括三角烧瓶、容量瓶、试管、量筒、吸管等）试验前都必须进行高压灭菌。

3.1.2 96孔V型微量反应板和微量移液器

试验前准备好96孔110°一次性V型反应板、吸头、单道和多道微量移液器。为防止交叉污染，有条件的最好一次性使用，以免清洗不干净、消毒不彻底，影响检测结果。移液器使用前必须进行校对，使用后应调至最大量程，以确保移液器量程精准。移液器吸取液体时不能抽吸太快，以免液体随惯性而上污染枪头，影响试验结果。

3.2 试剂的配制

3.2.1 缓冲液的配制

试验前应根据试验检测工作量配好p H7.20.01摩尔／升的PBS液和阿氏液，以免多配浪费或少配不够用。按 《高致病性禽流感诊断技术》（GB／T18936－2003）中的配制方法进行配制，配制完成后采用煮沸灭菌或高压蒸汽灭菌方法进行灭菌，防止配制过程中液体污染，对试验结果造成干扰。灭菌冷却后放入4℃冰箱保存备用，PBS液一经使用不得超过21天，配制时间过长，p H值发生变化，使凝集不明显，影响试验结果。

3.2.2 1％鸡红细胞悬液的制备

按照试验要求，鸡红细胞必须采自3只SPF（无规定动物疫病）公鸡或无禽流感抗体的健康公鸡，但在基层兽医实验室无SPF公鸡，所用鸡仅是未经免疫、眼观健康的公鸡。因此，在洗涤红细胞时应进行多次洗涤，直至上清液清亮透明为止，降低干扰因素对试验结果的影响。洗涤红细胞的最后一步应3000转／分钟离心10分钟进行红细胞压积，透明上清液吸完后，还应把上层白细胞层吸取丢掉，以免影响试验。配制好的红细胞悬液应置4℃冰箱冷藏保存，且在3天内用完，存放时间过长，红细胞破裂，影响试验结果。

3.2.3 4单位抗原的配制

在配制前应根据被检样品的数量，准确计算出所需抗原用量，用多少配多少，防止浪费。准确配制4单位抗原 （4HAU）是整个试验的关键一步，配制是否准确直接关系到试验的成败，因此必须进行回滴，回滴的目的在于验证4HAU抗原是否配制准确。回滴方法同HA试验，要求1HAU孔出现 “＋＋＋＋”，也就是100％凝集，即为配制正确。另外，应特别注意，4单位抗原必须当天配当天用，存放时间过长，抗原容易失效，夏天气温高时更应注意。

3.3 规范操作

（1）在使用微量移液器时，每个吸头应安装牢固，防止漏气，倍比稀释时移液器滴头不能离开液面，以免产生气泡，造成移液量不准确。另外，操作者在使用移液器时用力大小也影响移液量，因此用力大小也要适度，做到慢吸快推。

（2）4HAU抗原和1％红细胞悬液使用时应充分摇匀，加样时要边加边摇，且要防止右手左右抖动，保证每一孔中加入的浓度和量准确一致。

（3）被检血清样品应无菌采集、新鲜无污染，不要反复冻融，如果同一血清样品要用于检测多个病种，应合理安排试验或将样品分装，避免反复冻融。

（4）反应试剂应按规定保存和使用，冻干的抗原和阳性血清应按照瓶签标明剂量用PBS液溶解，用不完的要冷冻保存。试验前将所有试剂恢复至室温 （20～25℃）再进行试验操作，试验过程要严格控制反应温度和孵育时间，红细胞对照完全沉淀时要迅速判读，做到温度高时减少反应时间，温度低时延长反应时间。另外，如果夏季室温过高时，配制的各种试剂应及时放入4℃冰箱中保存，使用前再取出来。

（5）操作不当是人为导致试验结果误差较大或结果错误的主要原因。试验操作中不仅要遵循以上操作方法，更需在一些操作技巧和熟练程度上下功夫。例如单枪移液和多道移液器稀释的准确性、倍比稀释的一致性、完全血凝抑制的标准性等，都是影响试验结果的重要因素。建议基层实验室检测人员多参加培训、多加强练习，在操作中逐步掌握和领会禽流感血凝 （HA）和血凝抑制 （HI）试验的操作要领，做到规范操作。

（6）试验过程中做好人员防护。禽流感是人畜共患传染病，为防止直接接触或气溶胶感染，检测人员做好个人防护是确保试验正常开展的前提和不可忽视的重要环节。一是进入实验室应穿好白大褂、戴好口罩和手套；二是实验过程不用手接触眼、鼻、口和伤口；三是试验结束后对与试验有关的物品进行消毒处理及人员消毒。

总之，对血凝 （HA）和血凝抑制 （HI）试验影响的因素很多，基层兽医实验室由于受基础设施条件及人员素质等因素的限制，试验过程中还存在着很多问题，但只要每位检测人员都严格按照检测技术规程和标准，规范操作，检测结果就会更加准确。

［本文发表于 《保山畜牧业》2014.02期］