细菌的分布检查与消毒灭菌实验

实验三　细菌的分布检查与消毒灭菌实验

实验目的

1．了解细菌分布的检查方法。

2．掌握常用消毒灭菌方法。

3．熟悉常用消毒灭菌器的结构及使用方法。

4．熟悉药物敏感试验的结果观察及其临床意义。

实验内容和方法

一、细菌分布的检查（操作）

1．空气中细菌的检查　每组取普通琼脂平板1个，将盖打开，暴露于空气中5～10分钟，然后盖上盖，于平板底面注明标志（班级、组别、标本），置37℃培养箱培养18～24小时后观察结果。

2．咽喉部细菌的检查　每两人为一组取血琼脂平板1个，在平板底部正中画线一分为二。两位同学互相用无菌棉拭子于咽部采集标本，并将标本分别涂于血琼脂平板两边，再用灭菌接种环划线接种。在平板底面注明标记，置37℃培养箱培养18～24小时后观察结果。或取血琼脂平板1个，将盖打开，置于距口10cm处，用力咳嗽数次，然后盖好，在平板底面注明标记，置37℃培养箱培养18～24小时观察结果。

二、消毒灭菌

1．皮肤消毒试验（操作）　每两位同学取1个普通琼脂平板，用蜡笔将平板底部划分为五格，标明序号，两人用手指在培养基上各涂一格，然后用碘伏消毒手指后再各涂另一格，留一格作对照，盖好平板，置37℃培养箱培养18～24小时后观察结果。

2．热力灭菌试验（操作）　取5支肉汤培养基，标记1、2、3、4、5号，1、2号管接种大肠埃希菌，3、4号管接种枯草芽胞杆菌，5号管不接种细菌作对照，将1、3号管放水浴锅中煮沸5～10分钟，最后将5支肉汤管送37℃温箱培养18～24小时后观察结果。

3．紫外线杀菌试验（示教）　取普通琼脂平板1个，用接种环密集划线接种葡萄球菌后，以无菌镊子夹一张灭菌的长方形纸片贴于平板中央，将平板放在紫外线灯下20～30cm处照射30分钟，除去纸片（丢于消毒液中或烧掉，勿乱丢），置37℃培养箱培养18～24小时后观察结果。

4．常用消毒灭菌器及除菌滤器介绍（示教）

（1）高压蒸汽灭菌器：①结构：高压蒸汽灭菌器（手提式）是一个密闭的能耐高温的双层金属圆筒，两层之间盛水。外层坚厚，其上有金属厚盖，盖旁附有螺旋，借以紧闭盖门，避免蒸汽外溢。灭菌器盖上装有排气阀门、安全活塞、压力表及温度计等装置。器内装有带孔的金属隔板，用以放置待灭菌物品（实验图3－1）。②用法：使用时先加水至外筒内，然后把待灭菌物件放入内筒，不宜过挤。再将筒盖的螺旋拧紧使之密闭。灭菌器下用煤气或电炉等加热，并打开排气阀门，使筒内的冷空气完全排出，关闭排气阀。继续加热，待压力表渐渐升至所需压力103．4kPa（1．05kg／cm²），此时筒内温度为121．3℃，调节热源，维持15～20分钟可达到灭菌目的。灭菌完毕，停止加热，待压力降至零时，方可开盖取物。切不可在压力尚未降低为零时强行开盖取物，以免灭菌容器中的液体等冲出外溢，造成烫伤。

实验图3－1　手提式高压蒸汽灭菌器示意图

高压蒸汽灭菌是最有效而又快速的灭菌方法。凡耐高温和潮湿的培养基、生理盐水、手术衣、橡胶手套、手术器械、敷料、传染性污物等均可应用本法灭菌。

（2）干热灭菌器（干烤箱）：①构造：干热灭菌器是用双层金属板制成的方形箱子，中间有隔热的石棉板，箱底放置有热源（电炉）。内壁上有数个孔，让空气流通。箱前有铁门及玻璃门，箱内有金属箱板架数层。电热烤箱的前下方有温度调节器，其顶上装有温度计。②用法：将待灭菌的玻璃器材包装后放入箱内，闭门加热箱内空气，靠热空气灭菌。当箱内温度上升至160～170℃，保持2小时即可达到灭菌，然后停止加热，待温度自然下降至40℃以下，方可开门取物，以防玻璃器材遇骤冷炸裂。

一般耐高温的吸管、试管、培养皿、凡士林、液体石蜡等用本法灭菌。

（3）滤菌器：①蔡氏滤菌器：为金属滤器。以石棉为滤板，每次用完要更换石棉滤板。石棉滤板按孔径大小分为两种，K号可用于滤清，EK号能阻止细菌通过。②玻璃滤菌器：虑板用玻璃粉制成，用时比较方便，但孔径易被堵塞。孔径大小0．15～250μm不等，一般分为G1～G6等6种型号，其中G5、G6均可阻止细菌通过。

滤菌器常用于不耐热的培养基、血清、溶液及药液的除菌，也可用于细菌外毒素及病毒的分离。

三、药物敏感试验（纸片法）（示教）

1．取普通琼脂平板一个，以无菌操作要求用接种环取大肠埃希菌或葡萄球菌液体培养物，以密集划线法接种于琼脂平板表面。

2．待菌液稍干后，用镊子蘸取95%乙醇在乙醇灯上烧灼灭菌，冷却后分别夹取各种抗生素药敏纸片，贴于已接种好细菌的琼脂平板表面，用镊尖压一下，使其贴平，一次放好，不得移动。每取一种药敏纸片前，均须对镊子先灭菌。每张药敏纸片中心间距应大于24mm，纸片中心距平板内缘不小于15mm，直径为90mm的平板可贴6张纸片。

3．将平板放入37℃培养箱培养18～24小时后，观察抑菌圈（药物纸片周围无细菌生长的区域）的大小，了解抗生素的抑菌情况，判断药物的敏感度（实验图3－2）。一般以敏感、中介、耐药3个等级报告结果。

实验图3－2　细菌对药物的敏感试验

实验报告

1．记录细菌的分布检查试验结果。

2．记录消毒灭菌试验结果。

3．记录药物敏感试验（纸片法）结果，并分析其在临床上的意义。

（张文霞）