第二节 电子显微镜技术
一、透射电子显微镜技术
（一）基本原理与结构
把小于0．2μm的细微结构称为亚显微结构（submicroscopic structures）或超微结构（ultramicroscopic structures；ultrastructures）。1932年Ruska发明了以电子束为光源的透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM），电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，并且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说，电压越高波长越短，目前TEM的分辨力可达0．2nm，放大倍数最高可达近百万倍。
电子显微镜（简称电镜）主要由四部分组成（图1－3）：①电子束照明系统：包括电子枪、聚光镜。由高频电流加热钨丝发出电子，经高压使电子加速，经过聚光镜汇聚成电子束。②成像系统：包括物镜、中间镜与投影镜等。它们是若干精密加工的中空圆柱体，里面装置线圈，通过改变线圈的电流大小，调节圆柱体空间的磁场强度。电子束经过磁场时发生螺旋式运动，最终的结果如同光线通过玻璃透镜时一样，聚焦成像。③真空系统：用两级真空泵不断抽气，保持电子枪、镜筒及记录系统内的高真空。④记录系统：电子成像须通过荧光屏显示用于观察，或用感光胶片记录下来。
图1－3 透射电子显微镜的结构组成示意图
另外，由于电子在空气里穿透力很弱，所以电镜的镜筒必须抽成真空，否则高速运动的电子核气体分子相互碰撞，会使高速电子散射而偏离轨道，使电镜不能正常工作。电镜镜筒的真空度越高，其使用性能也就越好。
（二）电镜制样技术
1．超薄切片的制备：由于电子束的穿透能力有限，为了获得较高分辨率，需要使用超薄切片机制成厚度一般仅为40～50nm的超薄切片。
（1）固定是电镜样品制备过程中最重要的一个环节，若固定方法选得适当，样品的超微结构尽能十分接近活体状态。目前常用的固定剂为四氧化锇（OsO4）和戊二醛等。
（2）包埋的目的是要使样品中各种细微结构在切片中得到均匀良好的支撑，使切成的超薄切片仍能保持连续完整并且有足够的强度，并可耐受干燥以及电子轰击、高温和真空挥发。
（3）包埋好的组织需用超薄切片机切成超薄切片，其厚度一般是40～50nm，以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片。
（4）由于生物样品多是由C、H、O、N等元素组成，这些元素原子序数低，散射电子能力弱，在电镜下的反差很弱，因此通常需用高分子量的金属盐对超薄切片进行染色，以形成明暗反差。常用的染色液是醋酸双氧铀（易染核酸）和铅盐（易染蛋白质）。
2．负染色技术：一些细小的颗粒标本如线粒体基粒、核糖体、纤维蛋白、病毒等可以通过负染色（negative staining）电镜技术观察其精细结构，其分辨率可达1．5nm左右。最常用的染色剂是2%磷钨酸水溶液。
3．冷冻蚀刻技术：冷冻蚀刻（freeze etching）的基本操作过程是将样品用液氮固定后，然后装入专门的冷冻蚀刻仪中，在低温真空状态下进行断裂。这时样品往往从其结构相对“脆弱”的部位（如膜脂双分子层的疏水端）断裂。然后稍稍升温，使断裂面上的冰少量升华，这样埋在冰中的蛋白质颗粒的立体结构就会进一步增强，这一过程称为蚀刻。随后从45°方向用铂、金等金属进行喷镀，这样整个断裂面的微细结构就复印在这层金属薄膜上（又称复型膜），再从垂直方向喷一层碳，加固复型膜，最后用消化液把样品本身消化掉，将剩下的复型膜捞在载网上，干燥后用投射电镜直接进行观察。
二、扫描电镜技术
20世纪60年代，扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）逐渐引起人们的重视，其电子枪发射出的电子束被电磁透镜汇聚成极细的电子“探针”，在样品表面进行“扫描”，电子束可激发样品表面放出二次电子，二次电子产生的多少与样品的形状有关。二次电子由探测器收集，并被转化成光信号，再经光电倍增管和放大器转变成电压信号来控制荧光屏上电子束的强度。这样，样品不同部位上产生二次电子多或少的差异，直接反映在荧光屏相应部位亮或暗的差别，从而得到一幅放大的立体感很强的图像（图1－4）。
图1－4 扫描电镜下的血细胞
（石河子大学 谢 菁）
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