结核分枝杆菌的体外药敏试验

二、结核分枝杆菌的体外药敏试验

由于结核分枝杆菌生长缓慢，在生长前，药物已扩散至培养基中，不能有效影响其生长。故常用的需氧或兼性厌氧菌的药敏试验不适用于结核分枝杆菌。结核分枝杆菌体外药敏试验有绝对浓度法、比例法、快速药敏法、E试验法。目前，我国普遍采用绝对浓度法进行抗结核分枝杆菌的药物敏感试验。

(一)绝对浓度法

1．原理　以“无生长”为终点或以最低抑菌浓度(MIC)来判断耐药与否的试验方法　。

2．实验步骤

(1)药物原液的配制:配制原液需采用药物纯品，按照其效价计算药量。异烟肼(INH)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)、氨硫脲(TB₁)、乙硫异烟胺(TH)、环丝氨酸(CS)等生物效价按其重量单位计算，均为1 000μg/mg。链霉素硫酸盐等可按生产厂家标定的效价计算其盐型用量。

加入培养基中实际药量的计算可参考下列公式:

不同药物选用适当的溶剂溶解、稀释，除个别难溶于水的药物需用指定溶剂外，一般溶解与稀释均可用蒸馏水。每种药物按表6－5制成高浓度溶液，再按相应比例稀释成低浓度溶液。配好的储存药液根据实际工作量分装并保存在－20℃环境，不能反复冻融使用。

表6－5　常用抗分枝杆菌药物的稀释浓度、培养基中最终浓度及溶剂

(2)含药培养基的制备:按实际药量每100 mL在改良罗氏培养基中加入1 mL药液，混匀，分装，85℃凝固50 min，自然冷却后，37℃无菌试验24 h，检查污染情况后4℃保存，1个月内用毕。各种抗分枝杆菌药物在培养基中的最终浓度参见表6－5。

(3)菌液的制备与接种:刮取MTB培养物少许，放入到带盖的平底试管中，试管预先放10～20个直径为3 mm的玻璃珠和1 mL 0．5%吐温－80生理盐水，置于涡旋振荡器震荡约30 s，使菌悬液充分乳化，静置1min后加入灭菌蒸馏水调节菌悬液浓度，与1个麦氏单位的标准比浊管比浊，配成1 mg/mL的菌悬液，然后以灭菌生理盐水10倍稀释至10^－2 mg/mL待检。

(4)细菌接种:以灭菌刻度吸管准确吸取菌悬液0．1 mL分别接种含不同浓度的含药培养基和对照培养基(不含药物)上，转动试管使菌液均匀分布于培养基斜面上，斜放培养基于37℃环境中孵育24 h后，再直立培养4周，每周观察一次，到4周终止培养。

3．结果判读①敏感:含药培养基上无菌落生长。②低浓度耐药:低浓度含药培养基上菌落数大于20个，高浓度含药培养基上无或极少菌落。③高浓度耐药:低浓度含药培养基上菌落茂盛，高浓度含药培养基上菌落数大于20个(含药培养基上菌落数约占斜面面积1/4则报告1+;菌落数约占斜面面积1/2报告2+;菌落数约占斜面面积3/4则报告3+;菌落数呈菌苔样生长报告4+)。④实报菌落数:低浓度含药培养基上菌落数小于20个时，实报菌落数。

4．质量控制每批试验应以结核分枝杆菌参考菌株(H37Rv敏感株)10^－3mg检测含药培养基质量。接种10^－3mg要求对照培养基菌落数在200个以上且无融合，若菌落数低于50个时，要求重新做药敏试验。

(二)比例法

比例法是世界卫生组织(WHO)全球结核病耐药监测项目统一推荐的方法　。

1．原理　此法是在一种含药培养基上接种两种不同浓度的菌液，以含药培养基上的菌落数与不含药培养基上的菌落数之比作为药敏判定标准。

2．实验步骤

(1)含药培养基的制备:每100 mL L－J培养基基础液中分别加入异烟肼20μg/mL、链霉素400μg/mL、利福平4 000μg/mL、乙胺丁醇200μg/mL药物浓度1 mL后，85～90℃血清凝固器中间歇灭菌2次，药物的最终浓度为异烟肼0．2μg/mL、链霉素4．0μg/ mL、利福平40．0μg/mL、乙胺丁醇2．0μg/mL。

(2)菌液的制备与接种:配制1 mg/mL菌悬液的方法　参见绝对浓度法。将菌悬液1 mg/mL静置片刻，使其中的颗粒或菌块沉淀，再将该菌液稀释成10^－2mg/mL和10^－4mg/ mL两个浓度分别接种两套含同样药物的平板。每个平板的每一四分格内用巴氏滴管滴加3滴(每个角边滴加1滴)，约100μL。接种两种不同接种量的测试菌的目的在于取得较满意的菌落计数，供结果阅读和计算生长对照格与药物格内的菌落比例，据此判断测试菌对测试药物“敏感”或“耐药”。③孵育:待菌液干燥后，密封于可透过CO₂的聚乙烯塑料袋中，于35℃5%～10%的CO₂的环境下孵育。接种后1～2 d，观察对照试验平板上是否污染。7H10琼脂平板应观察整个孵育期，每周观察1次。根据CLSI药敏测定时间，结核分枝杆菌为3周，缓慢生长分枝杆菌为2周。

3．结果判读

菌落融合成片(≥500个菌落)　　　　4+

大部分融合(200～500个菌落)　　　 3+

100～200个菌落　　　　　　　　　 2+

50～100个菌落　　　　　　　　　　1+

＜50个菌落　　　　　　　　　　　 报告菌落实数

在两个浓度梯度的平板中，计数易数出菌落数的平板，与对照平板菌落数相比，计算耐药百分比。小于l%报告敏感，大于或等于1%报告耐药。

耐药百分比=含药培养基上菌落数/对照培养基上菌落数×100%。

4．质量控制参照绝对浓度法。

该法特点是结果较准确，因为可适当调整接种量对检测结果的影响，且具有可比性，但操作较繁琐，耐药性结果略高于绝对浓度法。