第十八章 结核病发病机制在动物模型 中的研究
一旦有毒力的结核分枝杆菌在肺中形成了牢固的感染，即可造成终身不愈的潜伏性感染，难以治疗。但是与此同时体内却可产生防止外源性结核分枝杆菌再次感染的能力（即所谓郭霍现象，亦称感染性免疫）。近1个世纪以来，科研人员对于结核病的发病机制曾进行了大量的研究，但收效甚微。少数存在于乳酪样病变的结核分枝杆菌何故能逃避体内活化的细胞免疫机制的杀菌作用，至今仍是一无所知。
从世界各地分离的结核分枝杆菌对人和实验动物的毒力差异很大。对于有关决定此种差异的遗传和分子机制所知不多。早期在豚鼠中所进行的实验证实，许多耐药的结核分枝杆菌的致病性较之敏感菌株为低，但在人类中的情况就并非如此。事实上多数的结核分枝杆菌的多种药物耐药菌（MDR－TB）仍可保留其感染性和毒力，特别是对HIV感染的个体。然而即使是具有免疫活性的接触者仍是难以免于发病。而且合并有HIV和结核病的疾病流行将构成在世界范围内消灭结核病的巨大威胁，迫使世界卫生组织（WHO）宣布结核病为“全球公共卫生的紧急状况”。
一、结核分枝杆菌毒力的测定
结核分枝杆菌临床分离菌株毒力的测定，一般是将Lowenstein－Jensen培养基上的生长物制成细菌悬液，光浊度比色法标准化，增量的悬液注射至家兔或豚鼠，以被攻击动物的平均死亡时间表示毒力的大小。虽然1～2个活菌即可使豚鼠致死，但一般的接种物中多含有百万倍的细菌用以进行攻击，使实验能在6～12个月内完成。在某些实验中，尚可用极大量的细菌攻击动物而使死亡百分率能在30d内测出，但是这种方法产生的超级全身性感染与人类中自然获得的疾病是截然不同的。另外还可用肉眼观察肺、肝、脾和淋巴结中结核病变的数量，而使此种毒力试验较为准确，即拟定一人为的0～4＋病变等级，或计数X线检查时肺中病变的数目。这些主观检定法也可进一步通过显微镜检查个别肺中病变而使之更为可靠，即用Gaffky型分级，或用选择脏器匀浆连续活菌计数。在后一情况下，可用相对死亡率或在标准时间内选择脏器中细菌生长的数量来检定毒力。这种方法可应用亚致死量的分枝杆菌直接注入肺中，因而与自然获得的人类疾病比较接近。
在毒力测定时，如果结核分枝杆菌分离物长期保存于培养基，特别是含有聚氧乙烯80（polysorbate 80）之类的去垢剂（可使形成光滑型单细胞细菌悬液），细菌将逐步减毒。最后细菌分离物可以完全对小鼠和豚鼠无毒。与此同时并有遗传学、抗原性和超微结构上的改变。这些改变中很多涉及细胞壁类脂的丧失，这是因为聚氧乙烯对菌体的去垢剂作用所致。
近交小鼠对分枝杆菌感染的抵抗力变化较大，这种反应上的差异已证实取决于1对染色体上bcgr基因的存在与否。早期研究这一基因在自然抵抗力表达上的作用时，系用小剂量接种量（104菌落形成单位CU F）BCG Montoreal静脉接种，在具有bcgr基因的小鼠（DBA/2.CBA，C3 H）中不能发现有细菌生长，但在C57BL/6和BA LB/c（bcgs）小鼠中则有广泛的生长。开始时原本认为这是由于单一染色体所致，但以后通过回交实验证实涉及一个以上的基因位点，而且发现在DBA/2（bcgr）小鼠脾脏内也有一些BCG Montoreal的生长，但其生长不及在C57BL/6或BA LB/c（bcgs）小鼠中所见者。bcgr基因对其他多数的BCG菌株或有毒力的结核分枝杆菌菌株的生长并无影响。如将BCG Momtoreal的剂量增至106 CFU，则可全部消除bcgr基因的影响。bcgr基因阻止经BCG免疫DBA/2小鼠保护性T细胞介导免疫应答的诱导。不过脾脏中生长量的减少却可影响免疫的持续时间。特别是在以大量结核菌攻击的情况下更为明显。在人类中寻求与bcg r基因相当的基因并未成功。
bcgr基因的作用一般表现在T细胞介导免疫产生以前。这种情况与天然抗结核抵抗力不受T细胞耗竭或亚致死量全身照射的影响的报告是一致的，而这两种处理方法一般均已知可消除已建立的细胞免疫。
二、结核分枝杆菌的毒力因子
毒力纯粹是一种细菌特有的活性，但其表现尚需取决于复杂的宿主－寄生物相互作用过程。结核感染可以视为两方面的竞赛，一方面是病原菌企图在肺中建力牢固的基地；另一方面则是产生能限制病原体进一步增殖和侵犯血流及其他部位的细胞防御机制。有毒力和减毒的结核分枝杆菌在实验动物的早期生长速度基本上是相同的，但当细胞免疫应答一旦形成，则只有有毒力的细菌可继续在肺内增殖，直至感染达到致死程度，毒力较低的菌株则先是处于长期的制菌状态，然后继之以缓慢下降时期，直至感染因子完全由组织中清除为止。在95%具有免疫活性的个体中，自然抵抗力的形成是由于持续性（潜伏）带菌状态的建立，这种状态能保护宿主免受致死性的感染。同时也能对同一细菌的外源性再次感染提供终身保护力以及对相关菌株的交叉保护力。在这些情况下，不大可能是由单一的毒力因子来决定如此复杂的细胞间相互作用过程的。实验证实，结核分枝杆菌特定菌株的毒力取决于许多实验变数，如宿主品系、其遗传背景、免疫活性和营养状态，以及用以攻击接种物的制备方式、接种量的大小和接种途径和是否有从中介入的病原体等。此外，由濒死的动物体内取出细菌的毒力一般较之在体外生长者为大，提示前者能产生在人工培养基上生长细菌所不具备或受到限制的毒力因子。但是体内生长的细菌却要受到组织匀浆、酶消化差速离心等方法处理，使其由组织碎片中释出，如此就有可能形成细胞聚集，从而使细菌聚集于肺部毛细血管。这样使其较之由含有聚氧乙烯的培养基培养的单个细菌悬液的毒力更强。
结核分枝杆菌如何杀灭吞噬细胞所知不多，反之亦然。中等量的有毒力结核分枝杆菌H37Rv菌株可以杀死小鼠的正常巨噬细胞，而加热杀死的结核分枝杆菌及其超声处理提取物则对小鼠正常巨噬细胞完全无毒性作用。一般均知，有毒的结核分枝杆菌产生许多毒性硫脂和分枝苷酸（mycoside）以及索状因子。这些复杂类脂在诱发疾病中的作用仍不甚清楚，其中有些可防止病原体免受活化的氧和氮代谢中间产物的杀菌作用，另有一些则可阻止或抑制溶酶体与吞噬体的融合。有的分枝杆菌能破坏吞噬体膜，从而使有毒的细菌进入细胞质。不论有关机制如何，最后的结果是有毒力的结核分枝杆菌能在吞噬细胞的防护性微环境中持续的生长，一项有关结核感染免疫应答的应予以重视的事实是，在肝脏和脾脏中免疫活化细胞防御机制能使90%以上的有毒力细菌灭活；但在肺脏内对相同细菌的生长很少有影响。即使在结核感染的脾脏中能显示明显的T细胞介导免疫应答，有毒结核分枝杆菌是否能在肺脏及其相关淋巴结中完全被消灭，还是有问题的。
三、结核分枝杆菌毒力基因的克隆化
尚未发现有决定结核分枝杆菌毒力因子产生的基因，这种基因应当是能作用于细菌在肺部吞噬细胞中的生存和生长的能力，而对无毒力菌株则因不能产生必需的毒力因子而被杀灭。结核分枝杆菌对小鼠有毒力的无毒菌株H37Ra不能在天然易感的C57BL/6（bcgs）小鼠的肺中生存，并且发生缓慢而持续的活力下降，直至感染完全在组织中消灭。即使是免疫缺陷的小鼠，分枝杆菌H37Ra也不能使其致死。因此这一菌株就成为研究H37Rv菌株可能毒力基因的理想菌株。H37Rv和H37Ra原本均来源于同一亲代菌株H37，两者的区别在于菌落形态和对家兔和豚鼠的毒力有所不同。这样就使H37Ra成为研究H37Rv毒力基因的良好工具，可利用新近发展的穿梭质粒来完成所需的传递。
（一）克隆化步骤
有毒力的结核分枝杆菌H37Rv在Proskauer和Beck培养基中生长14d后，由表面生长菌膜中以酚－氯仿提取细菌染色体DNA，在Braun匀浆器中机械处理破坏，然后用Sau3A消化基因组DNA，所形成的50kb片段在包装至λ－噬菌体头部并转导至大肠埃希菌以前，将其5′端连接至pYUB178整合穿梭质粒，以电穿孔法（electroporation）处理，使H37Rv文库置入对数生长的H37Ra，将重组体混合物冻存，以备以后在小鼠中检测毒力。
（二）毒力基因的检测
H37Ra重组混合体足够代表整个H37Rv的基因组，可将其静脉注射至小鼠，定期杀死动物，并测定肺和脾中仍存有的重组体的数目，与感染了相应载体对照（仅为质粒DNA）的动物进行比较。这种体内检测重组混合体的方法可以避免使用个别筛选大量毒力增强重组体的检测法，带有无关基因的重组体相当快地由脾中消灭；而带有H37Rv毒力基因者则可在体内生存。所发现的重组体经过在另一宿主体内传代后，3个月后脾中存在的重组体数目较之载体对照者为多，分离物以Southern印迹法检查。而且连接片段分析证实这些分离物都共有相同的25kb的DNA片段。重叠黏粒再次克隆至H37Ra，所有带有重叠黏粒的重组体都可在体内增殖，但带有非重叠黏粒者则不能在体内增殖。这些提示在小鼠中选择的重组体具有一个或一个以上的毒力基因（称为ivg基因以代表体内生长），此种基因能保证细菌在正常小鼠脾脏中的生存和生长。以后用这些重组体克隆进行巨噬细胞感染的研究证明，这些带有毒力基因的细菌在小鼠体内的细胞内生长可持续达7d之久。但载体对照者则不能在细胞内增殖。
四、bcg基因在分枝杆菌感染中的作用
正式遗传研究结果表明，小鼠对结核分枝杆菌的抵抗力受单一显性基因的控制。虽然这种抵抗力基因的性质尚不清楚，但可设想小鼠染色体1上的bcg基因可能与之有关。
（一）bcg基因的遗传分析
用所有近交系小鼠对BCG易感性的观察证明在bcg细胞内增殖方面可以区分为两种类型。提示BCG在小鼠中的这种不能控制的特性是受到单一基因的控制。F1，F2和回交动物（由有抵抗力的A/J与易感的B10A亲代小鼠交配生成）的正式分离分析结果证实了这一推断。所有的（B10.A x A/J）F1小鼠、约50%的（B10.A x A/J）F1x B10.A小鼠，以及约75%的F2小鼠均对BCG的增殖无反应。这些结果是与存在有一称之为bcg的单一作用于BCG抵抗力的显性位点一致的。在表型上可区别为两个等位基因的表现。即抵抗力等位基因（bcgr）和易感性等位基因（bcgs）。这一位点可能是位于小鼠的19对常染色体中的一个染色体上。
（二）bcg基因的作图
bcg基因在染色体上的具体位置是通过两个重组体近交品系（recombinant inbred strain，RIS）的连锁分析而得以确定的。这两个RIS分别是来源于BCG－敏感的C57BL/6亲代的BXD和来源于BCG－抵抗性DBA/2和C3 H/He亲代的BX H。RIS是由F2代的兄妹交配而形成。每一RIS都代表许多发生于亲代品系染色体间的重组过程。在染色体上密切连锁的亲代特异性等位基因在很多RIS中都是一起被检出，而未连锁的基因则在RIS中随机分离。对于所有的RIS中这两种基因亲代特异性等位基因的出现情况（即所谓品系分布程式）进行比较，可以确定这些位点是否连锁。由bcgr和bcgs等位基因在BXD和BX H RIS的品系分布程式得知，bcg位点位于小鼠染色体1的近侧区，在以往确定的基因标记Idh－1和Pep－3之间。
bcg基因表现型的一项重要方面为其严格控制分枝杆菌在网状内皮组织中早期生长的能力。此外，针对分枝杆菌感染的获得性免疫的后期则是主要受控于小鼠染色体17上的H－2基因。由此可见，小鼠中的分枝杆菌疾病的后果是几种宿主基因相互作用的结果。
（三）巨噬细胞上表达的bcg基因
bcg基因调节许多抗原性和种系发育上各不相同细胞内寄生病原体的早期非免疫性抵抗力的事实，提示巨噬细胞是表达此种基因的细胞类型，Gros等报告，bcg基因型在一一对900R照射有抵抗力的成熟巨噬细胞上表达。相似的结果亦可见于鼠伤寒沙门菌和杜氏利什曼原虫感染。现已证实表达Bcg基因的巨噬细胞能有效地降低BCG、鸟分枝杆菌、细胞内分枝杆菌和耻垢分枝杆菌以及杜氏利什曼原虫和鼠伤寒沙门菌的生长。
Bucchman，Blackwell，Zwilling等人分别检测了Bcg同类品系小鼠巨噬细胞活化的功能性和表型参数标记。由具有抵抗力的小鼠中分离的巨噬细胞较之由易感小鼠中分离者，在BCG被吞噬或在γ－干扰素（IFN－γ）刺激后，具有更大力度的己糖一磷酸支路和呼吸爆发活性。与这些结果相一致的是，有抵抗力动物的巨噬细胞在其他标记，如Ⅱ类Ia抗原、ACM.1和5′－核苷酸酶、脂多糖（LPS）诱发的肿瘤坏死因子（TNF）的产生和对抗原特异性和非特异性T细胞增殖的支持等，都有高水平的表达，另有两个由bcg同类系小鼠品系的无限增殖化骨髓巨噬细胞形成的克隆化巨噬细胞株，即B10S（bcgs）和B10R（bcgr）亦可用以分析bcg基因的分子特征。B10R－抵抗性细胞株与易感性的B10S细胞相比较，固有地表达增强的杀菌活性和高水平的IAβmRNA和Ia抗原。同样用IFN－γ处理后可在48h后诱导B10R的最大限度的Ia抗原表达，但在B10S巨噬细胞中仅在72h后方始有Ia抗原的表达。这种称之为“多效效应（pleiotrophic effect）”的bcg基因效应提示，由抵抗性小鼠中分离的巨噬细胞系在基因的控制下转向于启动化的状况。虽然尚未发现有任何参数与针对感染细菌的天然抵抗力有关，也未鉴定出任何可能的基因产物蛋白质，但也有一些可以作为基因产物的研究报告。
（四）bcg基因附近的高分辨基因作图
bcg基因是在研究传染病宿主遗传学时所用基因中的一例。有关这一位点的表型表达所知甚多，但尚未鉴定出其基因产物蛋白质。此种基因可用一种称之为反向遗传学（利用基因序列资料反过来研究体内的遗传学效应）、定位克隆化（positional cloning）或基因搜寻（gene hunting）方法由染色体位置上克隆化。克隆化的步骤包括：①在表型确定的位点附近进行高分辨基因作图；②通过基因分析确定位点基因组区域的长范围物理作图；③减数分裂图中紧密连锁两标记侧翼的整个基因组区域的克隆化；④由此克隆化的基因组片段分离出候选基因序列；⑤最适合表型确定位点特征候选基因的鉴定。
带有bcg基因染色体片段的高分辨基因图的建立在定位克隆法的成功应用上至关重要。最为理想的基因作图最好是每个标记隔开0.1厘摩（cM），如果认为重组是均匀地沿着染色体片段发生的，则这就意味着最少也有1 000个信息减数分裂过程可在基因实验中进行分析。而且如果重组热点或交换抑制发生于所研究的染色体片段时，这种数目还会有所增加。虽可应用现有的RIS，但仍需生成许多回交动物。所有用于构建基因图的小鼠必须有其bcgs和bcgr等位基因明显和确切的表达。
初步实验证实有5个克隆基因，即Cryg2（Len2），Fn，Alpi，Acrg，Vil位于小鼠1对染色体近侧区Bcg基因的6cM以内。这些结果在以后的作图实验中有所扩展，并且确切地证明bcg系位于一群细胞骨架和细胞外基质蛋白之内，这一观察结果促使推测认为bcg本身即可编码结构蛋白。更为重要的是，过去关于Bcg位置上30cM基因间隔已得到精确化，成为基因Tnp1和Des之间的间隔为1.1cM。以后又发现：①在350个芯息性减数分裂过程中并未发现Vil编码绒毛蛋白（villi）的基因和Bcg之间的重组，所以Vil是最靠近bcg位点的标记。②小鼠和人类基因图的比较分析证实，所有小鼠染色体1上连锁于bcg基因位点的人类同源物均系同线存在于人类染色体2上的端粒末端，即q32－qter区。但也有可能，在人类染色体2q的细胞遗传学定位分辨力范围内，人类和小鼠基因组间这些基因的次序仍是保守性的。由上述的一些观察可知，bcg本身就是一种超越种系的保守性连锁基因群，而且人类中的Bcg同源物很有可能在染色体2q的端粒区发现，这样就为研究人类结核易感性基因提供了靶区域。
以后的基因作图实验则是针对确定bcg和Vil之间的交换及增加bcg所在地1.1cM间隔标记密度。通过1 424个信息性减数分裂过程的分析得知，在Vil和bcg之间并未发现重组，提示这两种基因紧密连锁，也可能是同一基因。不过后一可能性可能被排除，因为Vil基因表达的组织分布程式并不与Bcg基因中所预期者相关。
（五）bcg附近的物理作图
连接紧密连锁于bcg侧翼基因标记的长距离物理图谱的构建为其克隆化的主要先决条件。应用脉冲凝胶电泳（PFGE）和荧光原位杂交（FISH）技术可以构建成含有7个在基因图上紧密连锁标记的物理图谱。其中有两个标记，即Vil和λMm1C165（这两标记不与Bcg，D1Mcg105和Tnp 1发生重组）已证实分别位于bcg近侧的0.1 c M和0.8 c M处。λMm1C136，Des，Inha则分别位于Bcg远侧的0.2 c M，0.5 c M和0.6 c M处。以后使用的方法为首先获得可用于这7种固定位点的噬菌体和黏粒基因组克隆，然后再分析这些大型插入基因组克隆是否有罕用限制性内切酶NotI，MluI或Bss HII的存在，并且含有这些罕用内切酶部位的DN A片段均须亚克隆化以供进一步分析。获取位于罕用内切酶部位两侧的DN A探针，并且以此应用于Southern印迹法，其中小鼠基因组DN A用相应的罕用限制性内切酶消化。因为探针系由罕用内切酶部位的两侧获取，故能保证检出Southern印迹法中最大长度的限制性片段。此种方法的目的在于鉴定能与来源于两个邻近固定位点（如Vil和D1Mcg105或λMm1C136和Des）的探针发生杂交的DN A片段。如果两个探针与同一限制性片段发生杂交，则隔开这些探针的最大物理距离即是限制性片段的长度。
由于紧接bcg的近侧区内有一群罕用内切酶部位聚集，所以bcg基因染色体区域图谱的建立手续极繁而且费时。这些基因的聚集多发现于转录花性基因的5′端区域，因而很有可能bcg是位于小鼠染色体1中的富含基因的部位。由于有无数罕用内切酶部位的存在，故不可能用PFGE来连接Vil区和λMm1C136－Des/Inha区，而必须用分裂间期作图来完成。分隔由Des至Vil间的物理距离测出为950 kb，这一距离较之原由基因分析者为大。考虑到基因距离和物理距离间的差异，很有可能是在这一染色体片段中的交换被抑制。与之不同的是，Vil近侧端的物理距离则与由基因分析所推定者相同，即用PFGE测出的由Tnp1至D1 Mcg105为1 000 kb，至λMm1C165为160 kb，至Vil为180 kb。准确评估分隔D1 Mcg105与λMm1C165，Vil和λMm1C136间的物理距离后，即可开始对bcg基因的基因组区域进行克隆化。
（六）带有bcg基因组间隔转录单位的克隆化
bcg基因克隆化的下一步骤为分离两个酵母人工染色体（Y AC）克隆以用作文库进入探针。已经分离出两个含有小鼠染色体1上跨越总共400 kb连续性DN A插入片段的Y AC克隆。Y AC插入片段的物理作图与相应基因组区域物理作图的比较证实，这些插入片段的确代表了基因组DN A。将两Y AC插入片段中的DN A亚克隆化至黏粒和噬菌体载体，并用外显子扩增（axon amplification）技术分析转录单位的表达。
外显子扩增的基础是，5′和3′端剪接位点决定由一内含子隔开的两个外显子的正确剪接过程，而不依赖于分子密度。例如，可以构建成一种剪接载体，使其在HIV－tat基因内含子内有一特殊的克隆位点，这种内含子的侧翼序列和剪接位点为家兔β－珠蛋白基因的另一内含子所替代。在外显子扩增时，将具有剪接活性的外显子序列克隆至载体。然后将这种构建物转染COS细胞，其中高水平的插入转录可由剪接载体中所含有的SV40qi启动子所驱动。对于异种全长RNA处理成无内含子的RNA应当视为正规细胞代谢的一部分。由转染细胞中分离胞质RNA，并用对侧翼λ珠蛋白载体序列特异的两个寡核苷酸的逆转录酶PCR扩增原始基因组中的任何一种外显子。
应用外显子扩增，可以由来源于YAC黏粒克隆中总共分离出22种外显子。应用序列比较、Northern分析、互补DNA（cDNA）文库筛选，可将这些外显子区分为7组密切连锁于bcg的独立转录单位，其中6个转录单位代表新的基因；一个外显子系来源于Vil基因。已分离出这6个新基因的全长cDNA克隆，并用以确定这些基因的组织特异性表达程式。其中有一基因表现已知能表型表达bcg的组织和细胞（肝、脾和巨噬细胞）上的RNA。由于其染色体位置及其表达程式，此种基因已被认为是bcg基因的最有可能的候选者，并已命名为“天然抵抗力相关性巨噬细胞蛋白基因”（Nramp）。
计算机协助的Nramp序列分析表明，这种基因编码一预期分子量为53×103的蛋白。其预期的结构特征提示它是一种膜结合的转运蛋白，Nramp蛋白含有10个跨膜功能区（TM），2个可能的N－连锁糖基化部位和2个可能通过蛋白激酶C磷酸化的部位。所检测的27株bcgr和bcgs的Nramp cDNA侧序结果表明，对感染的易感性与TM2中非保守性Gly－105至Asp－105的置换有关。故可设想，Gly为带电荷的Asp残基的置换能影响BCG易感小鼠的转运蛋白功能，这也的确是一种疾病突变。
Nramp蛋白的另一重要特征为在TM6和YM7之间有一保守性基序，称为“结合蛋白依赖性转运系统内膜成分特征”。这一基序的作用是将结合和水解腺苷三磷酸的亚单位耦联至细菌通透酶。在构巢曲霉（Aspergillus nidulans）的CmA基因（具有摄取硝酸盐功能通透酶的作用）中，也可检出有相同的基序。虽然Nramp和CmA在核苷酸和氨基酸水平上的一级序列同源性并不大，但在TM功能区的大小和数目，特别是转运蛋白基序上却有结构上的相似性。这种拓扑结构相似性提示Nramp也有浓缩硝酸盐/亚硝酸盐的作用。此种推论是很有意义的，因为已有事实表明一氧化氮和有关的反应性氮代谢中间产物（RNI）与巨噬细胞破坏有毒力的结核分枝杆菌相关。但是RNI产生的增强是否为bcg基因所介导仍不清楚，而且也难以将Bcg基因的多效效应归因于一氧化氮转运蛋白。在Nramp氨基末端序列中发现了一个Src同源的3′－结合功能区，促使有的研究者设想Nramp蛋白可能与信息传导有关。
（七）人类bcg同源物的搜寻
为了确定人类Bcg同源物能否影响对结核病的易感性，首先必须制备针对人类染色体2q35上小鼠紧密连锁Bcg位点的人类同源物VIL，TNP，DES的多态性DNA探针。此外尚加入不与2q35区域基因连锁并位于人类染色体2q端粒顶端的标记以作为内部对照，然后根据检出的多态性对亲代和家庭成员进行基因标记的分型。
连锁分析的目的在于估计两个位点间的重组频率（Θ），可用分析的最大可能性法检测Θ的观察估计值小于50%，即根据所观察的家系分布的概率，以Θ的最大可能性估计值来测定连锁。计算优势对数值（lod score）（奇数比率的log10），优势对数值小于－2者即可排除连锁的可能性，而大于＋3者则为两位点连锁提供有意义的事实依据。这种分析结果表明，在所检查的家系中，对结核病易感性与染色体2q端粒顶端连锁的可能性已被排除。但是以基因标记所作有关bcg基因的人类同源物密切连锁的结果则较为有意义。
就这些位点而言，已发现在CRYG基因群、T NF和结核易感性特征之间有连锁。在有些患结核病的家族中发现疾病与染色体2q35基因标记有连锁。优势级数值显示这种连锁主要发生于“流行病”家族，即在流行暴发时所有的家庭成员均与结核分枝杆菌接触过。而在“地方病”家族，即不同的家族成员在较长的时间内个别地患有结核病，一般这种连锁不存在或优势级数值为负值。
在T NP易感性之间可以发现有最高的连锁值和最低的重组部分。Schurr等获得了人类Nramp的c DN A，他们应用在Y AC克隆中的基因作图证实Nramp的确存在于染色体2q35，而且也阐明了相应基因的外显子－内含子结构及外显子特异性引物。合并使用单链构象多态性和直接测序技术，在人类Nramp基因中能确定许多多态性变异体。这些多态性目前正在测试其与结核易感性特征的协同分离（co－segregation），而且将为人类中的bcg同源体在对结核易感性的作用上提供结论性的答案。
（八）分枝杆菌获得性免疫的调节
已知主要组织相容性复合体（M HC）基因能调节免疫应答，而且是目前已知多态性表现最为普遍的基因。因此，不同的H－2或人类淋巴细胞抗原（H L A）等位基因必然与宿主所形成细胞免疫应答的类型和程度有关。但是，H－2基因与分枝杆菌感染免疫应答变异的连锁方面极难以判定，除非是用bcg易感背景的H－2同类系品系进行研究。有很多实例证明H－2基因对易感宿主免疫应答的作用，包括肉芽肿的形成和鼠麻风分枝杆菌感染过程中的细菌清除作用，BCG的32×103抗原刺激后IFN－γ的产生、对致死性结核分枝杆菌的易感性和BCG免疫接种后的保护效应。此外也有报告H L A－DR和H L A－DQ基因在麻风时对保护性和抑制性免疫的影响。
bcg基因控制着一种未经鉴定的巨噬细胞生化过程，这种过程有较快地活化杀灭分枝杆菌功能。此外，这种基因也能通过增强Ⅰa抗原的表达以及bcgr提呈抗原至T细胞的超级能力，从而影响获得性免疫应答。在BCG感染过程中，BA LB/c bcg r小鼠与bcgs小鼠相比较，能发生更为显著的纯化单白衍生物（PPD）－特异性T细胞增殖以及白细胞介素－2（IL－2）产生的增加。Schurr等发现，如用大剂量的BCG感染小鼠，由bcgs小鼠脾中分离的巨噬细胞可在体外抑制T细胞增殖。抑制信号是一种主要的机制，因为在有bcgr巨噬细胞存在的情况下，共同培养的bcg3巨噬细胞能消除T细胞增殖。虽这种抑制作用的机制尚不清楚，但现有资料提示，Bcg基因可以通过调节巨噬细胞活化及抑制作用而影响T细胞应答。
（余传霖）
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