定量分析方法的验证

由于生物样品取样量少、药物浓度低、内源性物质的干扰（如无机盐、脂质、蛋白质、代谢物）及个体差异等多种因素影响生物样品测定，为了保证方法的可靠性，必须建立生物样品分析方法，并对方法进行验证。

（一）特异性

必须证明所测定的物质是原型药物或特定的活性代谢物，内源性物质和相应的代谢物及同时服用的其他药物不得干扰样品的测定。对于色谱法至少要提供6个不同来源的空白生物样品色谱图、空白生物样品外加标准物质色谱图（注明浓度）及用药后的生物样品色谱图。

（二）标准曲线与线性范围

根据所测定物质的浓度与响应的相关性，用回归分析法获得标准曲线。标准曲线的高低浓度范围为线性范围，在线性范围内浓度测定结果应达到试验要求的精密度和准确度。

必须用至少6个浓度建立标准曲线，应使用与待测样品相同的生物介质，线性范围要能覆盖全部待测样品浓度，不允许在线性范围外推算未知样品的浓度。建立标准曲线时应随行空白生物样品，但标准曲线不包括零点。

标准曲线上各浓度点的实测值与标示值的偏差（bias）在可接受范围内时，可判定标准曲线合格。偏差可按下式计算：

式中，回归值是将各浓度点的响应值代入标准曲线计算所得的浓度值；标示值是指制备标准曲线时，各相应浓度点的配制浓度。

标准曲线上各浓度点偏差的可接受范围一般规定为：最低浓度点的偏差在±20%以内，其余各浓度点的偏差在±15%以内。只有合格的标准曲线才能对临床待测样品进行计算。当线性范围较宽时，推荐采用加权最小二乘法（weighted least square method）进行回归计算。

（三）精密度与准确度

要求选择高、中、低3个浓度的质控（quality control， QC）样品同时进行方法的精密度和准确度验证。其中，低浓度接近定量下限（lower limit of quantitation， LLOQ），在LLOQ的3倍以内；高浓度接近标准曲线的上限（即定量上限，upper limit of quantitation， ULOQ），中间选一个浓度，每一浓度至少测定5个样品。

精密度用QC样品的批内（intra-batch）和批间（inter-batch）RSD表示，RSD一般应小于15%，在LLOQ附近RSD应小于20%。

在测定批内RSD时，每一浓度至少制备并测定5个样品。为获得批间RSD应至少在不同天连续制备并测定3个分析批，至少45个样品。

准确度是指用特定方法测得的生物样品浓度与真实浓度的接近程度，一般应在真实浓度的85%～115%内，在LLOQ附近应在80%～120%内。

（四）定量下限

LLOQ是标准曲线上的最低浓度点，要求至少能满足测定3～5个半衰期时样品中的药物浓度，或cmax的1/10～1/20时的药物浓度，其准确度应在真实浓度的80%～120%内。RSD＜20%，S/N ＞ 5。应由至少5个标准样品测试结果证明。

（五）样品的稳定性

根据具体情况，对含药生物样品在室温、冰冻和冻融条件下以及不同存放时间进行稳定性考察，以确定生物样品的存放条件和时间。还应注意考察储备液的稳定性以及样品处理后的溶液中分析物的稳定性，以保证测试结果的准确性和重现性。

（六）提取回收率

应考察高、中、低3个浓度的提取回收率。其结果应一致、精密和可重现。

（七）质控样品

质控（QC）样品是将已知量的待测药物加入到生物介质中配制的样品，用于质量控制。

（八）质量控制

应在生物样品分析方法确证完成之后开始测试未知生物样品，每个样品一般测定1次，必要时进行复测。每个分析批均应建立相应的标准曲线，并随行测定高、中、低3个浓度的QC样品，每个浓度至少双样本。并应均匀分布在未知样品测试顺序中。当一个分析批中未知样品数目较多时，应增加各浓度QC样品数，使QC样品数大于未知样品总数的5%。 QC样品测定结果的可接受标准为：偏差应小于15%，低浓度点偏差应小于20%，最多允许1/3不在同一浓度的QC样品结果超限。如QC样品测定结果不符合上述要求，则该分析批未知样品测试结果作废。浓度高于ULOQ的未知生物样品，应采用相应的空白介质稀释后重新测定。