常用分析方法

开展治疗药物监测，分析技术的发展是必要的先决条件。血浆或血清中药物的浓度低，取样量又要尽可能少，且有时患者体内会含有不止一种药物，因此用于血药浓度测定的方法较体外药物测定的方法需要考虑的问题要更复杂，要求也更高。同一种药物可以用多种方法测定，选用时需权衡各方面因素。目前进行治疗药物监测的检测方法很多，最常用的有光谱法、色谱法和免疫法3大类。下面对3类方法进行简单介绍并将各种方法的优缺点进行比较(见表13－3)。

表13－3　常用的血药浓度测定方法

*由低到高顺序为:－，±，+，++，+++，++++。

13.3.3.1　光谱法

光谱法包括比色法、紫外－可见分光光度法(UV－Vis)、荧光法等。这类方法专属性差，灵敏度比较低，只能检测体液中药物浓度在1.0μg·L－1以上的药物，而且容易受代谢物或结构相近化合物的干扰。此外，这类方法所需样品量大，限制了其在血药浓度监测中的应用。但是，这种方法具有操作简单、价格低廉、速度快等优点，当条件有限时，仍是一种值得推广采用的方法。

当体内药物或其代谢产物在200～700 nm有吸收峰时，样品浓度在10－3～10－4 g·L－1范围内，通常选用UV法测定。UV法的优点是操作简便，费用低廉，测定速度快;缺点是专属性差，血液中的一些内源性杂质干扰大，测定前必须进行分离，因此，该方法单独用于TDM时常受到限制。但是，一些新的吸收光谱分析技术的不断开发已经使UV法得到优化，例如差示光度法、双波长法、三波长法、导数法、CPA矩阵法等用于TDM，极大得提高了UV法在TDM中的应用。

荧光法是基于物质的荧光性质所进行的定量分析方法。与UV法相比，该法具有灵敏度高、选择性强、取样量少的优点，但也存在着无法排除代谢物干扰的问题。同时，也因为许多药物本身不具有荧光特性而限制了荧光法的应用。因此，进一步强化生物样品的纯化手段、寻找适当的衍生试剂或者荧光衍生化方法才能扩大荧光法在TDM中的应用。

13.3.3.2　色谱法

色谱法是目前发展最快、适用性最强的一种方法。多数的检测技术对测量众多组分中某些低浓度的组分往往不理想，色谱技术是最适合测定体内药物浓度的分析技术之一。色谱法最大的优势就是它不仅具有优越的定量作用，更具有一次分离多种样品的作用，加之这种方法灵敏度高，能够测到的药物质量浓度可达0.001 mg·L－1～1 mg·L－1，尤其是近年来质谱的发展使得监测范围更加扩展，达到1.0×10－9mg·L－1～1.0×10－6mg·L－1甚至更低。

高效液相色谱法(HPLC)是目前临床上用于监测血药浓度最常用的方法，80%以上的抗癫痫药物的血药浓度检测都是用了HPLC法。这种方法检测灵敏度高、专一性强，常用的检测器有紫外检测器、荧光检测器和电化学检测器等。紫外检测器最小检出量为5×10－10 g·mL－1，适用于检测能吸收该波长紫外光的物质;荧光检测器最小检出量为10－6 g·L－1，适用于某些生物物质及药物代谢物等;电化学检测器最小检出量为20 nmol·L－1，适用于检测一些可电离的物质。但是，HPLC法对样品的前处理要求很高，样品中的大分子蛋白质及其他大分子物质必须处理完全，才能最大程度地减少对色谱柱柱效的影响，延长色谱柱的使用寿命。HPLC法操作费时，费用也相对较高。虽然目前也有在线净化富集生物体液的填料柱，针对以往HPLC法的缺点，样品无需预处理而直接进样，但这种方法增加了样品检测的成本。

液－质联用技术的发展为样品分析提供了广阔的空间。采用液－质联用技术是近年来分析方法学上的主要特点，质谱的联用为色谱的进一步发展提供了更为灵敏、准确的技术支持，在很大程度上扩展了高效液相色谱的应用范围，如监测血清中替米沙坦的浓度时，单用高效液相色谱法监测时，最低检测限为20μg·L－1，但当应用液－质联用进行监测时，可将灵敏度提高到0.5μg·L－1。

气相色谱法(GC)是将被测样品在一定温度下瞬间气化，由移动相带入固定相，具有选择性强、灵敏度高、取样量少、分析速度快、分离效率高等优点。气相作流动相黏度小，在色谱柱内流动的阻力小，气体的扩散系数大，使被测组分在两相中的传递速度快，有利于高校、快速的分离。气相色谱可用于低沸点、易汽化、热稳定性好的化合物。气相色谱法的缺点是要求被测组分或其衍生物必须具有一定的挥发性和热稳定性，因此，对于热不稳定或极性大的样品无法实现GC检测。体内药物分析中的待测药物大多不具有挥发性，因此气相色谱在体内药物分析中的应用相对较少。

13.3.3.3　免疫学方法

免疫学方法监测药物浓度主要是利用了蛋白竞争结合的原理。免疫学方法中的放射免疫法(RIA)、酶免疫法(EIA)和荧光免疫法(FIA)是较常用于血药浓度检测的方法。

放射免疫测定法(RIA)是将高灵敏度的放射性核素示踪技术与高特异的免疫化学技术相结合的一种超微量免疫测定方法，即用放射性核素标记抗原后，使其与受检标本中的抗原竞争抗体，检测标记抗原抗体复合物的放射性强度，据此确定药物浓度。RIA法有价格便宜、方法简单、结果可靠、灵敏度较高等优点，但也存在着一些缺点，如放射性污染、需要有同位素的防护设备、标记物半衰期短、批间RSD偏大、检测时间过长、容易受代谢产物的干扰等。

酶免疫测定法(EIA)是在放射免疫分析理论的基础上，用酶标记抗原或抗体作为示踪物的非放射性免疫分析技术，其灵敏度与RIA法接近，具有特异性强、灵敏度高、操作简便快捷、酶标记物稳定、有效期长等优点，克服了RIA放射性危害和标记物半衰期短的缺点。缺点是必须有大量的样品源，否则会造成试剂盒的浪费，反而使成本提高。EIA方法包括了酶联免疫吸附分析法(ELISA)和克隆酶免疫测定法(CEDIA)。

荧光免疫测定法(FIA)以荧光物质标记抗体而进行抗原定位，已广泛应用于微量、超微量物质分析测定。荧光免疫法灵敏度高，稳定性好。包括荧光偏振免疫测定法(FPIA)和时间分辨荧光免疫测定法(TRFIA)。荧光偏振免疫法(FPIA)既保留了荧光试剂的稳定性、又克服了容易淬灭的缺点，直接测定抗原抗体反应，准确度高，重现性好，分析全自动化，大部分样品在5～10 min即可测出。虽然荧光偏振免疫法使用的仪器价格昂贵，试剂需要进口，但由于其获得结果快速、样品处理方法简单、灵敏度高而受到临床的重视。TRFIA为一种新型非放射性免疫标记技术，利用了具有独特荧光特性的镧系元素及其螯合物为示踪物，代替荧光物、酶、同位素、化学发光物质，待反应体系发生后，用时间分辨荧光免疫分析检测仪测定反应产物中的荧光强度，根据产物荧光强度和相对荧光强度的比值，判断反应体系中分析物的浓度从而实现定量分析。

化学发光免疫测定法(CLIA)以化学发光剂、催化发光酶或产物间接参与发光反应的物质等标记抗体或抗原，当标记抗体或标记抗原与相应抗原或抗体结合后，发光底物受发光剂、催化酶或参与产物作用，发生氧化还原反应，反应中释放可见光或者该反应激发荧光物质发光，最后用发光光度计进行检测。

据统计分析，不同方法间测定结果的准确性相比:FPIA(荧光偏振免疫分析法)测定药物种类最多，准确性最高，稳定性最好;FIA(荧光免疫测定法)准确性也较好;UV(紫外分光光度法)主要用于茶碱的测定，准确性一般，但高于HPLC(高效液相色谱法)。HPLC理论上是一种精密度和准确度都很好的方法，但由于受操作人员的技术理论水平及仪器设备本身性能限制，误差通常更大。比较来看RIA(放射免疫测定法)的准确性和精密度是最差的。

总之，一种理想的血药浓度测定方法，除了应当具备灵敏度高、重现性好、专一性强的基本要求之外，还应具有操作简便、快速和价格低廉的优点，这是决定某项检测技术活仪器能否在临床上普及推广的重要因素。在目前的治疗药物监测工作中，液相色谱以其高分离及精确的定量，加上成本相对较低，在TDM中具有不可替代的地位。免疫法是临床应用较为普遍的方法，FPIA、FIA、RIA等方法也因其快速、灵敏而得到推广。其他检测方法如气相色谱、液－质联用、气－质联用技术在血药浓度监测中的应用不及以上两类。