建立气相色谱分析方法

5.5.1.1　直接进行GC分析的化合物

气相色谱法广泛应用于气体、挥发性物质及高温下可以气化的化合物的分离、分析。基于GC法进行体内药物分析方法的建立时，首先应充分了解待测化合物的理化性质(如分子量、结构式、沸点、稳定性等)，然后判断待测化合物是否可直接进行GC分析，或是通过衍生化的方法进行GC分析，很多气相色谱分析工作者结合自身的工作经验，总结了气相色谱分析方法开发的一般规律，在实际工作当中，应首先结合分析目的，查阅、参考相关资料。中国药科大学的丁黎教授将化合物是否可直接进行GC分析的经验如下:

(1)分子量小于500 Da的化合物，若分子结构中不含有具有活泼氢的极性官能团，如—OH，—NH2，—NH—，—COOH，—SO3 H，—SH，—CONH2，—CONH—，—SO2 NH2，—SO2 NH—等，且对热稳定，一般均可采用GC法进行分析。

(2)分子量小于200 Da的小分子化合物，若分子结构中含有以下5种官能团:—OH，—SH，—NHR，—CONH2，但分子结构中总的极性官能团数目不超过2个，并且对热稳定，一般均可采用GC法进行分析。

(3)对于不符合上述两条经验的化合物，又可进行如下判断:①糖类、氨基酸类、肽类、核酸类、蛋白质类等强极性化合物或者生物大分子肯定不能直接进行气相色谱分析，但糖类和氨基酸类化合物经过衍生化后可以进行GC分析;②很多分子量小于500 Da的中等极性化合物也可直接进行气相色谱分析，如硝苯地平、尼莫地平、地西泮、硝西泮等。

5.5.1.2衍生化气相色谱法

通常可直接进行气相色谱法分析的化合物很少，但通过衍生化方法后，70%～80%的药物可进行GC分析。例如，对于分子量小于500，但分子结构中含有—OH，—NH2，—NH—，—SH，—COOH，—CONH2，—CONH—等含活泼氢的极性官能团，这些化合物无法直接进行GC分析，但通过衍生化后一般可实现GC分析。

衍生化是一种利用化学变换把化合物转化成类似化学结构的物质。一般来说，一个特定功能的化合物参与衍生化反应后，溶解度、沸点、熔点、聚集态或化学成分会发生偏离，由此产生的新的化学性质可用于量化或分离。在GC法中，通常利用衍生化技术，将无法直接进行GC分析的待测化合物进行一定的结构改造，再进行GC分析。通过衍生化，可实现:①使不挥发或挥发性差的化合物变成具有一定挥发性的化合物;②降低被测组分极性，减少或消除拖尾及吸附现象;③改变样品组分理化性质，提高分离度;④提高待测组分在检测器上的响应;⑤通过衍生化获得更多的结构信息。

通常，气相色谱法中的衍生化方法包括:硅烷化、酯化、卤代衍生化、酰化等。

1.硅烷化反应

凡具有活泼氢的化合物(如醇、酚、胺、酸等)均可进行硅烷化反应，最常用的硅烷化反应试剂是三甲基硅烷(TMS)，其机制为硅烷化试剂(TMS)取代极性官能团上的活泼氢。硅烷化反应后生成的衍生物具有热稳定性好、挥发性强、易于制备、色谱性能好等优点。硅烷化反应过程如下:

被衍生化合物的各极性官能团接受硅烷基的能力依次为:醇(伯＞仲＞叔)＞酚＞羧酸＞胺(一级胺＞二级胺)＞酰胺。

常用硅烷化试剂包括:三甲基硅烷(TMS)、三甲基氯硅烷(TMCS)、六甲基二硅烷(HMDS)、双(三甲基硅烷基)三氯乙酰胺(BSTFA)、双(三甲基硅烷基)乙酰胺(BSA)、三甲基硅烷基咪唑(TSM)等。

2.烷基化反应

烷基化反应是指衍生试剂分子中的烷基取代化合物中的酸性氢，其反应如下:

其中，X为卤素或其他易离去基团。衍生物是醚、酯、硫醚、N－烷基胺、N－烷基酰胺等。弱酸基团的烷基化需强碱催化剂，酚羟基和羧酸羟基等酸性较强，需弱碱催化剂。

3.酯化反应

含羧基的药物大多数挥发性差，热稳定性低，且由于该类化合物极性较强，在气相色谱法中容易产生拖尾现象，通过酯化反应形成结构相应的脂。最常用的方法为重氮甲烷衍生化，其反应如下:

RCOOH+CH2=N=N—→ RCOOCH3+N2↑

4.酰化反应

酰化反应可以降低具有氨基、羟基、巯基等官能团的化合物的极性，并提高其挥发性。其反应实质是衍生试剂的酰基取代极性化合物中的活性氢。酰基化衍生试剂主要有酰卤，酸酐、酰基咪唑、酰胺及烷基氯甲酸酯等。酰化反应如下:

5.卤代化反应

通过引入卤原子可使待测化合物使用电子捕获检测器，并提高灵敏度。常用卤代衍生化方法有如下几种。

卤素法:用卤素直接作为衍生化试剂处理样品，卤素的作用是加成或取代。

RCH=CH2+Cl2—→ RCHClCH2 Cl

卤化氢法:以HCl和HBr为衍生化试剂，与不饱和链发生加成反应或与羟基发生置换反应。

RCH=CH2+HX—→ RCHXCH3(X=Cl，Br)

上述各种衍生化方法需结合实际分析目的和化合物理化性质具体选用，通常判断衍生化方法是否得当的指标有:①衍生化反应是否迅速、定量进行，反应重复性如何，反应条件是否温和，且便于操作;②所选的衍生化反应是否选择性高，衍生化试剂能否单一的与目标化合物进行反应;③衍生化反应的产物是否唯一，反应的副产物和过量的衍生化试剂不得干扰目标化合物的分离及检测;④衍生化试剂要求通用性好，价格低廉并易于得到。

5.5.1.3　气相色谱法与高效液相色谱法的选择比较

在体内药物分析的实际工作中，很多化合物既可以通过气相色谱法进行分析，也可以利用高效液相色谱法进行分析，例如，人血浆中尼莫地平的测定，既可以采用HPLC－UV法，也可以采用GC－ECD法，这种情况下，应结合分析需求，综合考虑分析方法的专属性、灵敏度、分析成本及方便程度等几个因素。一般情况下认为，HPLC法的进样准确度和精密度要好于GC法，但GC法具有操作简单、节省液体流动相等优点。

5.5.1.4　检测器的选择

结合实验室条件和分析需求，选择合适的检测器对分析方法的开发至关重要。通常情况下，对于含碳有机化合物的分析可考虑选择火焰离子化检测器(FID)，对于含有强电负性元素的化合物可选择电子捕获检测器(ECD)，对于含有氮、磷元素的化合物可选择氮磷检测器(NPD)，对于含有硫、磷元素的有机化合物可选择火焰光度检测器(FPD)，对于永久气体、水等无机物的分析可选择热导检测器(TCD)。

由于生物样品中的药物是痕量的，浓度一般较低，因此利用气相色谱法进行体内药物分析时，通常选择具有较高灵敏度和高分离效能的毛细管柱气相色谱法，而检测器通常选择电子捕获检测器或质谱检测器。