常用的体内药物分析方法

目前，用于体内药物分析的方法有很多，归纳起来主要有以下几类。

3.1.2.1　色谱分析法

色谱技术(Chromatography)是研究体内药物及其代谢物最强有力的手段，其在体内药物分析中的应用始于20世纪80年代。其分离原理是:溶于流动相(Mobile Phase)中的各组分经过固定相(Stationary Phase)时，由于与固定相发生作用(吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和)的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。由于色谱技术具有很高的选择性和较高的灵敏度，因而可同时分析结构相似的药物和代谢物等。

色谱法中以高效液相色谱法(HPLC)最为常用，适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。正相色谱法采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)，流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正己烷、环己烷)，常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间，通常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等)。反相色谱法一般用非极性固定相(如C18、C8)，流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间，适用于分离非极性和极性较弱的化合物。反相高效液相色谱法(RP－HPLC)更具有试剂价廉、方法简单和适应范围广等优点，现已成为体内药物分析方法中最重要的方法。据统计，RP－HPLC占整个HPLC应用的80%左右。

气相色谱法(GC)以气体为流动相，根据固定相对样品中各组分吸附或溶解能力不同而进行分离。GC在体内药物分析方法中也占有重要地位，只要在气相色谱仪允许的条件下可以气化而不分解的物质，都可以用气相色谱法进行测定。对部分热不稳定物质或难以气化的物质，通过化学衍生化的方法，仍可以采用气相色谱法进行分析。毛细管气相色谱法，由于其柱效高，可分析复杂的混合物(如兴奋剂的检查)，因而在体内药物分析中具有很好的应用前景。气相色谱法可用于体液和组织中脂肪酸、甘油三酯、维生素和糖类等的分析，在药物分析中可用于抗癫痫药、中成药中的挥发性成分、生物碱类药品的测定。

高效毛细管电泳(HPCE)是20世纪80年代后期发展起来的经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物，是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力的新型液相分离分析技术。与HPLC相比，HPCE分离效率高、速度快，所需样品、试剂用量少，在体内药物分析中得到了广泛应用。HPCE可以在185～210nm波长下进行检测，可以测定分子中不带生色团的药物，扩大了检测范围。目前HPCE在药物滥用监测、毒品检验、戒毒工作方面有独特的优势。

3.1.2.2　联用分析法

目前使用较广泛的联用分析法为色谱－质谱联用分析法和色谱与核磁共振联用分析法。

色谱与质谱的联用是应用于药物分析中最为活跃的技术，能够使样品的分离、定性、定量一次性完成。色谱技术为质谱分析提供了纯化的试样，质谱则提供了准确的结构信息。

液相色谱－质谱联用(LC－MS)是目前最重要的分离分析方法之一，HPLC的高分离性能和MS的高选择性、高灵敏度及丰富的结构信息相结合，已成为体内药物分析研究中强有力的工具。在液质联用系统中，HPLC在常温环境下工作，输送、分离样品，相当于质谱的进样器;而质谱的灵敏度高(可达到10－12～10－15 g)，定量、定性的能力很强，所以可看成是色谱的检测器。目前，与质谱联用的色谱技术主要有气相色谱(GC)、液相色谱(LC)、毛细管电泳(CE)等。1976年，Hewlett－Packard公司开发了第一台商品化GC－MS。经过几十年的时间，GC－MS已经发展成为一种比较成熟的分析技术，在石油化工、环境监测及农业等领域的应用非常广泛。在药物研究领域中，由于许多药物是热不稳定或难挥发性的化合物，而GC－MS要求样品能够气化，受到样品挥发性的限制，因而可以直接用GC－MS进行分析的不到已知药物总数的20%。对于挥发性差或热不稳定的化合物，虽然可以采取水解、硅烷化等预处理方法，但增加了操作上的麻烦，而且常常破坏样品。因此，GC－MS技术本身的特点限制了其在药物分析中的广泛应用。与GC相比，LC不受样品挥发性的限制，适用范围广，可以分析热不稳定、难挥发的化合物以及蛋白质、多肽、多糖等生物大分子物质。

液质联用可分为单级的LC－MS和多级的LC－MS/MSn。LC－MS/MS技术具有比LC－MS更优越的性能，更能充分发挥质谱检测灵敏度高和特异性强的特点，特别适用于分析复杂生物基质中的痕量待测物。由于MS/MS可以产生大量的碎片离子，弥补了LC－MS在定性鉴别上的不足，相对于LC－MS可以提供更多的结构信息，因此，LC－MS/MS是目前在药物定性、定量研究中应用最为广泛的色谱质谱联用技术。对于药物的定量研究而言，LC－MS/MS利用其多级离子选择的特殊性质，在MRM扫描方式下，在保证质谱高灵敏度的同时，能极大地提高分析方法的特异性，减少或消除了样品中无关物质的干扰，使得许多以前无法进行的痕量分析和鉴定成为可能。同时该方法可以简化生物样品的制备和分离过程，大大加快了样品的分析速度，特别适合对分析速度要求较高的生物样品及临床生物样品的测定。在药物及其代谢物的定性研究中，LC－MS/MS利用母离子扫描、子离子扫描和中性丢失扫描等多种扫描方式，结合同位素标记等技术，在分离鉴定药物的新型代谢产物、确定药物体内代谢途径等研究中起到了别的分析技术所无法达到的作用。因此，目前LC－MS/MS已经广泛用于药物及其代谢物的定性和定量研究。

3.1.2.3免疫分析法

免疫分析法(Immunoassay，IA)在体内药物分析中，尤其是在TDM中也是常用的一类分析方法。其原理是利用抗原－抗体的特异反应来测定体内药物的含量。它将分析方法与免疫原理相结合，进行超微量分析，具有灵敏度高、选择性强、操作简便、快速、用量少、样品一般不需进行预处理等优点。因此，该法特别适合分析大批量的低浓度的体液样品。其缺点是测定药物的种类受试剂盒供应的限制，且测定结果的准确度不如色谱法。根据对抗原标记方法的不同，免疫分析法可分为放射免疫分析(Radio immunoassay，RIA)、酶免疫分析(Enzyme immunoassay，EIA)、化学发光免疫分析(Chemiluminescence immunoassay，CLIA)及荧光免疫分析(Fluorescence immunoassay，FIA)等。

3.1.2.4　光谱分析法

光谱分析法(Spectroscopic Analysis，)包括比色法(Colorimetry，COL)、紫外分光光度法(Ultraviolet Spectrophotometry，UV)、荧光分光光度法(Fluorospectrophotometry，FLUOR)和原子吸收分光光度法(Atomic Absorption Spectrophotometry，AAS)。光谱分析法是体内药物分析中应用较早的方法之一。其特点是仪器结构简单，测定快速简便。但由于这些方法本身不具分离功能，易受到结构相近的其他药物、代谢物及内源性杂质的干扰，因而其应用正逐渐减少，仅适用于分析一些浓度较高、含干扰成分较少的样品。但是光谱法中的荧光分析法由于灵敏度高，可分析浓度极低的药物(10－13 g·mL－1)，已经成为了体内药物分析中不可缺少的方法。此外，原子吸收分光光度法在测定体液中微量金属元素方面也占有特殊的地位。

3.1.2.5　电化学分析法

电化学分析法(Electrochemical Analysis)是一类基于电池内发生电化学反应而建立起来的方法。测定时，通过选择适当的电极组成化学电池，以测定电压、电流、电阻、电量等电信号强度变化来对药物进行定性和定量分析。该类方法的特点是仪器设备简单、操作方便，易于实现测试的连续化和自动化。本法由于受到方法灵敏度和选择性的限制，不如色谱法、免疫法应用广泛，但在测定体内某些离子型化合物以及具有电活性的药物时具有独特的作用。