1.Caco-2细胞单层模型
Caco-2细胞来源于人体结肠癌上皮细胞(human colon adenocarcinoma cells)，培养可形成单层细胞，其生理结构和生化特性类似于人小肠上皮细胞，存在于小肠上皮中的多种转运载体、代谢酶，其药物透过速率与人口服吸收程度有较好相关性。药物在Caco-2细胞模型中的转运过程为:药物分子从Caco-2细胞单层的肠腔侧(即细胞单层与空气或培养液接触的面)跨过细胞或经过细胞间隙到达基底侧(与聚碳酯膜接触)。
(1)Caco-2细胞单层模型的特点优点:可作为药物吸收研究的快速筛选工具;细胞水平研究药物的吸收、转运、代谢;可同时研究药物对黏膜的毒性;与人体不存在种属差异;细胞生命力强，容易培养。
该模型的不足为:缺少肠壁的黏液层;缺少细胞异质性;缺少部分代谢酶;与结肠上皮细胞类似，与小肠有一定差别。由于细胞传代及培养条件的差别，各实验室所进行的相同实验的具体数据间可能存在较大差异。
(2)表观通透系数(the apparent permeability coefficients，Papp)
Papp=(ΔQ/Δt)/(AC0)
ΔQ为在Δt时间内通过单层的药量;A为扩散面积(cm2);C0为供侧池中初始药物浓度(μg/mL)。
结果判断:Papp＞10-6cm/s，药物吸收较好;Papp＜10-7cm/s，药物吸收很差。
2.Calu-3细胞模型
Calu-3细胞来源于人支气管黏膜下层腺癌，接种在多孔膜上可以分化成极化的、由纤毛细胞和分泌细胞组成、具有紧密连接的细胞单层，具有纤毛和黏液等呼吸道上皮。Calu-3细胞接种密度一般为500 000个/cm2。
Calu-3细胞单层模型的P-gp转运与Caco-2细胞模型同样具有竞争抑制现象，多底物同时存在时，可以使底物的外排现象减少，在细胞内的蓄积增加。
为了测定目的底物通过何种路径进入细胞，可以在37℃下测量底物的吸收总量，在4℃下测量被动吸收量。主动吸收可以用吸收总量和被动吸收总量的差值估算。主动吸收过程具有显著的温度差异性，37℃时的吸收量远高于4℃时的吸收量，由此可以判断药物的吸收过程是主动转运还是被动扩散过程。
实例7-1丹参酮ⅡA自微乳制剂大鼠在体单向灌流肠吸收研究
【文献来源:赵晓旭，李江英，崔延堂，孙哲，张亚军*.丹参酮ⅡA自微乳制剂的体外释放和在体肠吸收评价.中华中医药杂志，2012，27(8):2189-2191】
1.大鼠在体单向灌流实验
取禁食过夜(自由饮水)的SD大鼠，腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液(40mg/kg)麻醉并固定，沿腹中线剪口约3cm，插入硅胶管，于十二指肠入口3cm处手术线固定。回盲端上行3cm开另一小口，用生理盐水(预热37℃)冲洗肠道内容物，插管并结扎，稳定10min后泵入空气，将肠道内剩余液体排尽。
精密称取丹参酮ⅡA自微乳制剂(TA-SMP)0.5g置100mL量瓶中，用K-R缓冲溶液稀释并定容，即得TA-SMP灌流供试液。同法制备丹参酮ⅡA混悬液的灌流供试液，加入0.5g CMC-Na增加稠度。实验开始前用供试液(预热37℃)充填肠道以替换生理盐水，以0.25mL/min的速度平衡40min。进口处用已知质量的装有供试液的小瓶灌流，出口处放另一已知质量的小瓶收集流出液，每隔15min迅速更换下一个供试液小瓶和接收液小瓶，称量换下的供试液小瓶和接收液小瓶的质量。实验持续时间90min。实验结束后在不拉扯肠道的情况下将灌流肠段取出，测量长度(l)和内半径(r)。
2.肠循环液中丹参酮ⅡA浓度的测定
取不同时间点大鼠在体单向灌流液样品，用2倍体积的甲醇稀释，涡旋混匀，离心5min(10 000r/min)，取上清液，HPLC测定，计算药物浓度。HPLC色谱条件(略)，在此色谱条件下，空白肠循环液及制剂辅料对丹参酮ⅡA的测定无干扰。精密称取已知含量的TA-SMP加至空白肠循环液中，计算低、中、高3个质量浓度(0.178，0.890，4.45μg/mL)的精密度为1.63%，1.25%，1.07%(n=3)，回收率分别为97.4%，98.8%，98.4%(n=3)。丹参酮ⅡA在肠循环液中3h内基本稳定，丹参酮ⅡA的含量为初始浓度的94.7%，RSD%为2.15%(n=3)，能够满足实验要求。
3.肠壁物理吸附的影响
取冲净后的空白小肠段，用玻璃棒将黏膜层翻出，置于TA-SMP的灌流供试液中，在37℃水浴中孵育2h，取出肠段，测定孵育液丹参酮ⅡA的含量。结果显示，孵育液中药物浓度为初始浓度的93.5%，RSD%为2.35%(n=5)，可认为肠壁黏膜对药物基本无物理吸附作用。
4.数据分析
按照下列公式，计算药物的吸收速率常数(Ka)和表观吸收系数(Papp):
式中Vin和Vout分别为灌入和收集的供试液体积(mL);Cin和Cout分别为进口和出口处缓冲液中的药物质量浓度(μg/mL);l和r分别为被考察肠段的长度(cm)和内径(cm);Q为灌流速度(mL/min);V为被考察肠段的体积。
肠吸收数据处理后用统计分析软件SPSS16.0进行方差分析。结果表明，TA-SMP的吸收速率常数和表观吸收系数大于混悬剂，二者存在显著性差异(P＜0.01)，见表7-1。
表7-1 丹参酮ⅡA自微乳制剂和混悬液的肠吸收参数(n=5)
注:与混悬液相比aP＜0.01
(张亚军 冯 琳)
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