基本方法与步骤

(一)样品准备

常需要进行基因突变检测的样本有:手术切除的新鲜组织、石蜡包埋组织、血液成分、胸腔积液、腹水等。虽然不同样本的准备方法有很大差别,但样品准备的基本目的都是将组织分散成单个细胞,以便裂解细胞。

1.新鲜组织样品准备 取待检组织0.2~1.0g(可依据组织种类、DNA提取方法或提取试剂盒要求确定组织量),剪成小块,移入预冷研钵,快速用力研碎。为避免各种消化酶的影响,在提取过程中有时应做相应的处理,如肝脏组织提取前应去除胆囊,富含DNA酶的组织(胰腺、淋巴结等)在研磨组织时可加少许液氮等。

2.石蜡包埋组织 切取石蜡包埋组织5~8片(10μm/片),切除多余部分石蜡,小心刮取并收集待检组织至高压灭菌过的塑料微管(microtube,1.5 ml),加二甲苯0.5~1ml混匀,至于65°C水浴,15~30min,弃掉二甲苯,此过程重复2~3次。再加100%乙醇0.5~1ml混匀,室温放置5~10min,弃掉乙醇,重复1次。然后依次加90%,70%,50%乙醇0.5~1ml,每次加乙醇后混匀,室温放置5~10min,离心(8000r/min,5min),弃乙醇。

3.外周血、胸腔积液、腹水 对于准备提取DNA的外周血和红细胞含量较高的胸、腹水标本需要用抗凝剂处理。常用的抗凝剂有EDTA(0.5M,p H 8.0)、ACD(0.48%Citric Acid,1.32%Sodium Citrate,1.47%Glucose)和肝素。由于肝素对PCR反应有抑制作用,所以用于基因检测标本的抗凝剂常是前两种。胸腔积液、腹水标本应离心(3000转/ min,15min),以富集细胞,但红细胞较多时(或外周血标本量大于200μl)需要加样品体积3~5倍的蒸馏水,离心(8000r/min,5min),裂解并去除红细胞。

(二)细胞裂解

常用的细胞裂解的方法有SDS法、酶法和化学物质裂解法(如KI,常用于外周血基因组DNA提取),使细胞裂解,蛋白质变性。

(三)分离纯化

传统分离纯化DNA、去除蛋白质等混杂分子的方法是通过有机溶剂萃取(饱和酚/氯仿/异戊醇),近年来不断涌现出新的用于DNA分离纯化、吸附的材料,如硅基质吸附材料、阴离子交换树脂和磁珠等。

(四)DNA收集

传统的有机溶剂萃取方法分离纯化DNA通常是用乙醇沉淀,而吸附材料分离纯化法则是用缓冲液从吸附柱上将DNA洗脱、收集。

(五)DNA浓度、纯度测定

1.DNA浓度、纯度测定 用分光光度计测定DNA样品在260nm、280nm下吸光度值(分别为A260和A280),可以计算出DNA样品浓度,并检测纯度。

DNA浓度计算公式:DNA浓度(μg/μl)=A260×50×稀释倍数/1000

DNA纯度检测:一般用A260/A280值反应检测DNA样品纯度。A260/A280值为1.7~2.0说明DNA纯度较好;小于1.7表示可能有蛋白污染;而大于2.0则表示可能有RNA污染或DNA已降解。

2.琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA质量 将DNA样品用琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭(EB)为染料分析DNA样品质量。与已知分子量的DNA(电泳Marker)比对,可估计DNA样品平均分子量,如果提取质量较好,分子量可在20~50kb,且显示单一条带;DNA若有降解,则条带弥散。

(六)标本保存

1.组织标本 手术切除组织、外周血等新鲜标本如不能及时处理,应迅速至于-20℃或-70℃冰箱冷冻保存,应尽可能避免反复冻融。

2.DNA样品 可保存于蒸馏水或TE缓冲液(p H8.0),分装后置于-20℃或-70℃冰箱冷冻保存,可长时间保存,应尽可能避免反复冻融。