原位操作程序

原位PCR的基本操作程序包括:标本制备、预处理、反转录反应(仅检测RNA需要)、PCR扩增、扩增后处理及原位信号检测。

(一)标本制备

1.标本种类

(1)细胞标本:细胞标本包括培养细胞、人或动物外周血细胞及体液细胞等。可将固定好的细胞悬浮于PCR反应体系中进行PCR反应,扩增后经离心或涂片使细胞贴附于玻片,然后检测;也可以先将细胞固定在玻片上,在玻片上进行PCR扩增和信号检测。

(2)组织标本:包括石蜡切片和冷冻切片标本。通常做原位PCR石蜡切片厚5μm,冷冻切片厚5~10μm。

2.标本处理 不同种类标本的处理方法各异。细胞涂片与培养细胞爬片固定多用甲醇/醋酸(3∶1)或2%~4%多聚甲醛,样品置于-20℃冰箱储存;悬浮细胞固定多用4%多聚甲醛,标本需置于25倍体积的70%乙醇,储存于-20℃冰箱;新鲜组织块则多用10%缓冲福尔马林隔夜固定;石蜡包埋组织切片常规脱蜡、水化后可直接使用。

(二)预处理

1.细胞材料 不需处理或仅用去垢剂(Triton、NP-40、Tween-20等)处理。

2.组织切片 固定后需用蛋白酶(胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K等)或去垢剂处理,以增加细胞膜通透性和去除与靶DNA或RNA结合的蛋白质。消化后用加热或洗涤等方法除去剩余蛋白酶。

(三)反转录反应

反转录反应是检测标本中RNA的必需步骤,检测DNA不需要。反转录反应之前应先用DNA酶去除组织细胞基因组DNA,以确保模板仅源于RNA。

(四)PCR扩增

由于受组织细胞结构等因素的限制,原位PCR的扩增效率不如普通液相PCR高。因此,其反应体系和反应时间与液相PCR也均有差别。

1.引物选择 原位PCR所用引物应稍短,可一对或多对,扩增片段长度最好为100~500bp。

2.反应体系浓度 引物、Taq酶、d NTPs和Mg2+的浓度均要高于常规PCR,Mg2+浓度可在0~9mmol/L,Taq酶浓度可为15U/50μl。

3.牛血清白蛋白(BSA) 原位PCR反应体系中要加适当量的BSA,以防止Taq酶与载玻片结合引起的扩增效率降低。

4.保温时间及循环周期 与普通PCR相比,原位PCR每一步骤(变性、退火、延伸)的保温时间都应相对延长,循环次数一般设定在25~40。

(五)扩增后处理

1.洗涤 原位扩增结束后,标本要充分洗涤,以去除扩散到细胞外的扩增产物,减少非特异性背景着色。

2.扩增后固定 洗涤后标本用4%多聚甲醛或2%戊二醛固定,以减少扩增产物弥散。

(六)原位信号检测

1.直接法原位PCR的检测 直接法原位PCR的扩增产物含有标记物,可根据标记物类别选用相应的检测系统直接检测。如核素标记的用放射自显影检测,荧光素标记的用荧光显微镜观察,生物素标记的通过卵白素用辣根过氧化物酶-DAB显色系统检测,地高辛标记的用抗地高辛抗体-碱性磷酸酶-NBT显色系统检测。

2.其他原位PCR的检测 间接法原位PCR、原位反转录PCR、原位再生式序列复制反应的PCR扩增产物都不含有标记物,需选用特殊标记的探针进行原位杂交,然后根据标记物种类,确定检测方法。

(七)注意事项

原位PCR技术操作步骤多,流程长,易产生假阳性或假阴性结果。因此,进行原位PCR实验时必须设置一系列对照实验。主要分为PCR反应对照实验(如已知阳性和阴性标本对照、同一样本液相PCR对照、模板对照、Taq酶对照等)和检测系统对照(参照原位杂交的对照实验设置)。

附1:石蜡切片间接法原位PCR操作程序

1.标本制备 组织标本经10%缓冲福尔马林固定、石蜡包埋,制成5μm厚切片,贴于APES处理过的载玻片上,60℃烘烤过夜。

2.预处理

(1)石蜡切片常规脱蜡至水。

(2)用0.2mol/L的HCl处理10min。

(3)用5μg/ml蛋白酶K消化组织37℃,10min。

(4)用RNase消化组织37℃,30min。

(5)梯度乙醇脱水,室温干燥。

3.PCR扩增

(1)滴加PCR扩增反应液30μl到组织切片上,覆盖好硅化盖玻片,石蜡油封边。

PCR扩增反应液组成物质浓度:上、下游引物均为1μmol/L,d NTPs 250μmol/L, Taq酶10U/100μl,1×PCR缓冲液(p H8.3 Tris-HCl 10mmol/L,KCl 50mmol/L,MgCl2 2.5mmol/L),BSA 3mg/ml。

(2)PCR热循环(原位PCR仪上进行):94℃1min,55℃1min,72℃1.5min,共30个循环,72℃延伸10min。

(3)氯仿洗脱盖玻片,4%多聚甲醛后固定10min,梯度乙醇脱水,干燥。

4.原位杂交

(1)切片滴加地高辛标记探针杂交液,98℃变性10min,-20℃退火5min,42℃杂交过夜。

(2)用2×SSC洗涤3次,每次10min;1×SSC洗涤3次,每次10min。

(3)PBS洗涤3次,每次10min。

(4)滴加碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体复合物37℃,2h。

(5)PBS洗涤3次,每次5min。

(6)NBT、BCIP暗处显色,镜下观察控制显色时间,终止显色。

(7)常规脱水,透明,封固。

附2:细胞标本原位反转录PCR操作程序

1.标本制备 离心法将细胞沉淀在APES处理过的载玻片上,10%缓冲福尔马林固定。

2.预处理

(1)用0.2mol/L HCl处理10min,DEPC-TBS洗涤2次,每次3min。

(2)用0.3mg/ml蛋白酶K消化,54℃,20min。

(3)加热95℃、3min,灭活残存的蛋白酶。

(4)DEPC-TBS洗涤2次,每次3min。

(5)无RNA酶的DNA酶Ⅰ处理(750U/ml三蒸水),置于湿盒,室温,过夜。

(6)DEPC-TBS洗涤2次,每次5min。

(7)梯度乙醇脱水,室温干燥。

3.反转录反应

(1)将反转录反应液滴加到样品上,置于湿盒,42℃,1h。

反转录反应液组成物质浓度:下游引物1U/μl,AMV反转录酶1U/μl,RNasin 1U/μl, d NTPs 250μmol/L,1×反转录反应缓冲液(25mmol/L Tris-HCl p H8.3,37.5mmol/L KCl,1.5mmol/L MgCl2)。

(2)载玻片置于2×SSC-DEPC溶液95℃,10min灭活反转录酶。

(3)梯度乙醇脱水。

4.原位扩增

(1)组织切片上滴加PCR扩增反应液50μl,覆盖硅化盖玻片,石蜡油封边。

PCR扩增反应液组成物质浓度:上、下游引物各1μmol/L,d NTPs 200μmol/L,Taq酶8U/100μl,1×PCR缓冲液(p H8.3的Tris-HCl 10mmol/L,KCl 50mmol/L,MgCl2 2.5mmol/L)和BSA 3mg/ml。

(2)PCR热循环(原位PCR仪上进行):94℃,5min,然后进行如下循环:94℃5min,55℃1min,72℃1.5min,共35个循环,72℃延伸3min。

(3)DEPC-TBS洗涤2次,每次5min。

(4)无水乙醇固定10min,风干。

5.原位杂交 同附1原位杂交步骤。