脂肪组织衍生干细胞组织工程的动物和临床研究前景

未来的实验设计需要将多种因素考虑在内，这些因素包括：研究方法，所制作组织器官类型，结构和自然发展过程，细胞类型，支架材料，周围组织以及动物和临床试验的安全性和有效性。

（一）方法

广义上的组织器官工程可以应用多种方法。最简单的模式就是将细胞注射于外周血液循环，期望细胞归巢到需要修复的组织或器官的位置，或者使用精巧的导管将细胞注射于损伤部位邻近的血管内，或者经外科手术或直接注射于损伤部位。另一种方法就是将种子细胞或者生物活性物质种植于待移植的支架中，在活体内发展成组织或器官，或通过体外组织工程技术形成组织器官，然后将该组织器官移植于动物或患者体内。

在未来的实验设计中，所应用的试验方法决定是否需要动物实验。动物实验中的动物必须与临床上所要制造的组织器官尽可能的相近。只有动物实验方法证明安全有效，或者临床风险小时才可能开始进行临床试验。

在体外重建复杂的组织器官工程需要合适的条件，如生长所需的充足养分、生物活性物质、合适的机械刺激，而进行活体组织器官工程时，移植的支架材料需要在移植区域有良好的血液供应，也需要智能支架可以定时释放需要的生长因子和生物活性因子。

（二）组织/器官的类型和结构

受损组织器官的类型、结构、部位及周围组织的情况在选择组织工程的方法时起着至关重要的作用。相对简单的器官如心脏、肝脏只由一种类型的实质性细胞组成，在部分损伤时不需组织器官工程来修复，通过一种简单的方法在周围血或邻近供血动脉注射特定的干/祖细胞就可以发挥修复作用，这种方法已经在其他再生医学研究中得到应用。但是，问题也随之而来，即注射的干细胞是否真的分化成所需的细胞，抑或注射只是提供了所需要的生物活性和生长因子，因而提供原位干细胞分化成所需细胞的合适微环境，又或者是注射促使新生血管形成以提供养分和氧气修复缺损组织。而且，对这种干细胞归巢机制的理解在应用这种方法时具有很大的优势。因此，对各种干细胞在修复器官时的归巢机制研究将是一个非常令人兴奋的探索领域。

然而，对于像肾脏一样具有多种功能性结构和细胞的复杂器官，在制作组织工程器官时，就需要仔细考虑对于细胞类型的选择、应用可以定时释放各种所需生物活性物质的精密支架材料、精心设计支架而使其尽可能接近器官的生理结构和机械性能，并且可以允许血管长入、形成肾小球和肾的血管网络以及随后的支架神经化。这样，组织工程器官才可以更好地整合在受体体内，并且发挥功能。包括在组织和器官发育过程中每一个阶段中起决定性作用的细胞类型、细胞间的相互作用、细胞外基质、生长因子和生物活性物质、“开和关”的信号转导通路以及微环境。

在设计未来的动物和临床研究时，需要精确调控生长因子和生物活性物质的定时释放，使其尽量模拟其自然的生物环境中特定的信号转导通路的“开和关”状态。这种状态类似自然发育过程中的微环境变化，可以导致细胞增殖、分化，以及细胞外基质和生物活性物质的分泌，最终帮助所制造的组织/器官完成发育。

（四）细胞类型

（三）自然发育

在动物/临床试验中需要考虑所制造组织工程器官的组织自然发育问题。因此，了解胚胎中组织/器官的发育情况至关重要，

人们在脂肪组织衍生干细胞组织工程制备中，应该首先从不同类型的脂肪组织衍生间充质干细胞中（包括整体的脂肪组织衍生间充质干细胞、富含特定成分的部分、部分分化的祖细胞或者完全分化成成熟类型的细胞中）选择适合的细胞类型。对脂肪组织衍生间充质干细胞特性和潜力的研究将有助于对应用细胞类型的正确选择。在未来的工作中，在不同的动物模型组织工程中检验各种脂肪组织衍生间充质干细胞将是临床研究的先决条件。

每克脂肪组织仅包含5000个干细胞，而组织工程需要百万个干细胞，例如，大鼠的急性缺血性卒中引起的脑卒中实验研究中应用了2.0×106个脂肪组织衍生干细胞，复杂肛瘘患者的临床试验则需2000万～4000万个脂肪组织衍生间充质干细胞。因此分离的干细胞需要经过体外扩增以获取足够的数量。

不管细胞分化与否，细胞的扩增方法很多，后者包括从采用传统的培养皿和培养液培养到应用各种支架材料、生物反应器的大规模扩增。对不同类型脂肪组织衍生间充质干细胞进行扩增研究时，不管细胞分化与否，衍生出一个可以适用于每一种脂肪组织衍生间充质干细胞的标准操作程序非常重要。另外，在需要未分化的脂肪组织衍生间充质干细胞时，这一标准操作程序应该可以防止细胞自发的分化和衰老，或者可以决定在自发分化和衰老时所能达到的最高传代数。

（五）支架材料

在需要应用支架时，适当选择组织工程的材料以模仿需要制造组织器官的细胞外基质特性和自然结构非常重要。因此，应用各种智能支架材料营建适合组织器官工程的自然宏观与微观结构，涉及这一领域的研究前景非常广阔。在构建这类支架时，可将几种智能材料结合起来，以达到自然的细胞外基质的特性和体系结构，以及在所制造的组织/器官自然发育过程中释放各种因子的效果。

支架材料的宏观形态可以影响营养成分的供应。厚度小于100µm的支架材料可从周围环境获取足够的养分，而大于100µm的材料则需要在材料内生成一些毛细管网，并且材料内需要包含有相互交通的空隙。另外，有些支架材料如聚乙烯醇或者聚乙烯酸酯，它们含有甲基丙烯酸，可以在不应用生长因子的情况下引起血管化。关于胚胎血管形成的研究揭示了各种生长因子和生物活性物质的作用。

（六）安全性、整合性和有效性

在组织器官工程的研究中，关于应用骨髓衍生间充质干细胞和其他一些细胞的动物和临床试验不胜枚举，在安全性和有效性上面取得较好结果的报道也不鲜见。因此，应用脂肪组织工程方面的动物实验和临床试验来探讨工程组织/器官的整合性、整体程序的短期，长期的安全性和有效性都具有重大的意义。

1.安全性　安全问题主要是指整个程序的安全性，包括排斥反应问题。在实验设计时，人们需要考虑前面几节所讲到的各种问题。然而，当应用完美的支架材料与具有免疫原性和（或）异体的脂肪组织衍生间充质干细胞相结合时，对于如何克服免疫反应的研究就变得至关重要。应用无免疫原性的支架材料时，应该将细胞包被于支架材料的纳米微粒中。然而，当选择的适合支架材料具有免疫原性时，有几种预处理方法可以保护制造的组织/器官免于伤害，例如在其表面进行藻酸盐、肝素、多硫化物的涂层保护。这些方法的缺点就是有降低营养成分及氧气弥散的可能。因此，发展一种在不降低营养成分及氧气供给的情况下，规避受体免疫监视的涂层方法，意义尤为重大。

保护支架或细胞具有免疫原性外表面的另外一种方法就是通过黏附补体激活调节因子，例如：H因子（衰退加速因子）、APT070（改进的人类补体受体1片段），或者CR2（CD21），在保持细胞表面活性的同时，通过类似于Pluronic®的联结子附着于细胞表面。这些方法或通过防止级联系统激活或通过结合固有免疫系统的调节子，来保护移植物免于受体固有免疫反应的损害。然而，多数这些方法并没有在动物实验或临床试验中得到应用。未来的研究需要在动物实验和临床试验上验证这些支架或者细胞规避受体固有免疫反应的能力。

尽管脂肪组织衍生间充质干细胞本身具有免疫抑制的潜能，但是应用异体脂肪组织衍生间充质干细胞尚需谨慎。因此，未来的动物实验需要证实异体脂肪组织衍生间充质干细胞在脂肪组织衍生干细胞组织工程中的应用是否是真正的安全。

另外，由于干细胞的潜能很多，在一个特定部位应用干细胞并不能保证细胞停留在原地而不向非预期的部位移动。这样，人们就需要进行长期的安全性研究来监测这些可能发生的不良反应。

2.整合性和有效性　在组织工程中应用脂肪组织衍生间充质干细胞的临床试验才刚刚开始。一些试验正在招募参与者，其中一个试验已经开展，不过已经不再招募更多的参与者；另一个试验还没开始招募；另外还有两个试验遭到禁止；还有一个已经完成。在一个组织工程的临床试验中，应用纤维蛋白胶作为支架材料，应用扩增的整体脂肪组织衍生间充质干细胞或者未经扩增的基质血管碎片治疗克罗恩病导致的肠外瘘，结果发现接受扩增细胞的实验组组织具有更高的整合性和功效。另一个临床试验中，应用纤维蛋白胶和脂肪组织衍生间充质干细胞的移植物治疗复杂性肛瘘取得了良好的效果，不过其中17.6%的患者1年后出现复发现象。

因此，在设计动物实验或者临床试验时，人们必须考虑治疗的长期有效性，而且需要长期随访监测其疾病的复发率。组织工程的器官组织是否可以延续至整个生命周期，还是只能维持一段时间，认清此点至关重要。而且，在体内应用组织工程技术制造的组织/器官或经体外组织工程移植入体内的组织/器官应该能够与供体周围组织整合在一起发挥其有效功能，并且能够存活下来。

因此，未来的脂肪干细胞组织工程动物和临床研究，应该在应用骨髓衍生干细胞或者胚胎干细胞株的组织/器官工程的动物和临床研究取得成功的基础上进行，研究同时应该把安全性和有效性包括在内。